Colección de Microorganismos con Interés Biofertilizante (CMIB)

Study Extent

Las accesiones de la CMIB fueron colectadas en 16 departamentos del país: Magdalena, Cesar, Sucre, Córdoba, Antioquía, Santander, Caldas, Boyacá, Cundinamarca, Tolima, Valle del Cuca, Cauca, Huila, Nariño, Guaviare y Meta a partir de 1976. Otras fueron adquiridas mediante donaciones de diferentes centros de investigación a nivel mundial, como la Universidad de Wisconsin-Madison, la Universidad de Malaya, la Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria (Embrapa), la Secretaria de Agricultura & Suelos y el Ipea (Brasil), el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, la Universidad de Sídney, la Universidad Estatal de Carolina del Norte y el Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria de Argentina, y un gran número de accesiones son provenientes del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT).

Sampling

La colección CMIB contiene microorganismos asociados a la rizósfera, el rizoplano y la endósfera de diversas especies de plantas. El protocolo de aislamiento de las muestras consistió en una recolección de muestras de suelo, homogenización, incubación, caracterización morfológica y identificación molecular. Adémás se describen las metodologías para la caracterización de las bacterias y hongos que se depositan en la colección (Solubilización de fósforo, Producción de indoles totales, Fijación biológiva de nitrógeno, metódo de flotación).

Quality Control

En el proceso de estructuración y validación de los datos, se realizó el control de la calidad de la información. A continuación, se enumeran los procesos asociados a esta actividad: 1. Revisión de la información documentada asociada a los datos biológicos; 2. Estructuración de los datos en el estándar Darwin Core (DwC) según elementos, definiciones y vocabularios controlados; 3. Validación y limpieza de la información consignada en el DwC, 3.1. Corrección de errores de tipeo, para esta tarea se usó OpenRefine, adicionalmente se identificaron datos erróneos haciendo uso del Validador de datos - GBIF.

Method steps

1. Lo CMIB contiene microorganismos asociados a la rizósfera, el rizoplano y la endósfera de diversas especies de plantas. En términos generales, el protocolo de aislamiento involucra los siguientes pasos: 1) Muestras de suelo o tejido vegetal son colectadas y conservadas a 4ºC hasta que se procese. 2) Las muestras de tejido o suelo son desinfectadas y posteriormente homogenizadas en PBS estéril y las diluciones son preparadas. 3) Las suspensiones homogenizadas son sembradas sobre medios de cultivo selectivos o semiselectivos e incubadas a la temperatura apropiada. 4) Las colonias que se obtienen se purifican y se caracterizan morfológicamente. 5) Los aislados se identifican molecularmente mediante análisis de la secuencia 16S rRNA.
2. La caracterización de las accesiones bacterianas depositadas en la colección CMIB consistió en la capacidad biológica de fijación de nitrógeno y disposición de diferentes elementos y compuestos. La metodología se describe a continuación: Solubilización de fósforo: La determinación del fósforo liberado por las cepas se lleva a cabo en el me dio liquido srs (composición en g/L: KH2 PO4 : 0.2; K2 HPO4 : 0.8; MgSO4 * 7H2O : 0.2; CaSO4 : 0.1; MoO3 : 0.001; sacarosa : 5; FeSO4 * 7H2O : 0.04, y azul de bromotimol: 0.5) (Sundara Rao & Sinha, 1963), suplementado con fosfato tricálcico - Ca3(PO4 )2 - al 5 % (p/v). Los ensayos son realizados por triplicado. Los inóculos son ajustados en solución de NaCl (0,85% [p/v]) DO600 = 0.500 (aproximadamente 108 células/mL). Luego, se inocula 1 mL de la suspensión bacteriana en 10 mL del medio srs en erlenmeyer de 50 mL. La incubación se lleva a cabo a 30 ± 2 °C por 12 días con agitación constante a 120 rpm (Estrada et al., 2013). Al final de este periodo, el fósforo soluble se cuantifica con el método de azul de fosfomolibdeno, usando una absorbancia de 712 nm (Murphy & Riley, 1962; Watanabe & Olsen, 1965). Previamente, se realiza una curva estándar con concentraciones conocidas de 0, 4, 8, 10, 15, 20, 100 y 150 mg/L de K2 HPO4. Producción de indoles totales: La producción de indoles es determinada a partir de la fermentación líquida en el medio de cultivo YMA suplementado con triptófano (100 ug/mL); se toma 1 mL de cultivo y se centrifuga a 16000 xg durante 6 minutos; posteriormente, se reaccionan 100 µL del sobrenadante con 100 µL del reactivo de Salkowski en placas Elisa. La reacción se incuba por 30 minutos a temperatura ambiente y en completa oscuridad. Todas las muestras se realizan por triplicado. Una vez pasado el tiempo de reacción, se determina la absorbancia en un espectrofotómetro a 550 nm. Con los datos de absorbancia, se obtiene el promedio de las réplicas y se reemplazan los datos en la ecuación de la recta de la curva patrón, para determinar la producción de indoles totales (Carreño-Lopez et al., 2000; Glickmann & Dessaux, 1995). Previamente, se realiza una curva estándar utilizando concentraciones conocidas de 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 y 200 mg/L de ácido 3 indolacético. Fijación biológica de nitrógeno: Se evalúa la capacidad de las accesiones bacterianas para fijar N, mediante la nodulación de plantas trampa pertenecientes a fríjol caupí (Vigna unguiculata). Esta planta es seleccionada por ser la hospedera de un amplio rango de rizobios (Broughton, 2003). Las semillas de V. unguiculata son pregerminadas en sustrato estéril de vermiculita + arena (2:1) durante 48 horas; posteriormente, las semillas germinadas se siembran en bolsas plásticas con capacidad de 2 kg, que contienen el mismo sustrato estéril. Las accesiones bacterianas se multiplican en caldo yma durante el tiempo requerido para cada microorganismo (concentración: ± 108 ufc/mL, y se inoculan 5 mL de cada inóculo a las semillas. El experimento es realizado bajo condiciones semicontroladas, en invernadero, durante 60 días. Posteriormente, se realiza un muestreo para verificar nodulación en las 3 repeticiones establecidas. Seguidamente, se realiza la prueba de ARA (acetylene reduction assay) a las raíces noduladas siguiendo la metodología reportada por Grove y Malajczuk (1987). Las raíces noduladas se introducen en frascos herméticamente cerrados con un volumen de 280 mL, a los cuales se le sustituye el 10 % (v/v) de la atmósfera (28 mL) con acetileno, y se incuban durante una hora a 32°C. La concentración de etileno se cuantifica inyectando 1 mL de la atmósfera del frasco en un cromatógrafo de gases (Agilent Technologies GC-FID 7890ª), columna HayeSep N (20 pies, 1/8 pulgada, 2 mm), flujo N2 20 mL/min (gas arrastre).
3. El aislamiento y la identificación de las accesiones de hongos formadores de micorrizas arbusculares (HFMA) consistió: Para el aislamiento y la cuantificación de HFMA, se utiliza el método de flotación en un gradiente de sacarosa, en el cual las esporas quedan suspendidas en la interfaz del gradiente después de la centrifugación. Adicionalmente, se utiliza polisorbato, un agente que ayuda a disgregar partículas de materia orgánica para liberar las esporas que se encuentran atrapadas en este gradiente. Este método permite realizar la observación y conteo de esporas de HFMA, y para esto se necesita que el suelo que se va a procesar se haya secado a temperatura ambiente. Las esporas son extraídas a partir de 10 g de suelo y se pasan por tamices de 500, 250 y 38 µm, con el fin de separar la materia orgánica. Luego, las muestras son centrifugadas a 4000 xg durante 5 minutos en 15 mL de solución de sacarosa al 70 % (p/v). Posteriormente, se saca la interfaz formada y se deposita en el tamiz de 38 µm para retirar los restos de la solución de sacarosa, para finalmente depositarla en una caja de Petri para su posterior observación en estereoscopio (Gerdemann & Nicolson, 1963).

La Colección se compone de bacterias y hongos, las bacterias pertenece a los filos Proteobacteria (clases alfa-, beta-, y gamma-proteobacteria) y Firmicutes (principalmente familia Bacillaceae).

1. Bacteria
   rank: kingdom
2. Actinobacteria
   rank: phylum
3. Actinobacteriota
   rank: phylum
4. Firmicutes
   rank: phylum
5. Proteobacteria
   rank: phylum

Los hongos son formadores de micorrizas arbusculares (principalmente Glomeromycota).

1. Fungi
   rank: kingdom
2. Glomeromycota
   rank: phylum

Las accesiones de la CMIB fueron colectadas en 16 departamentos del país: Magdalena, Cesar, Sucre, Córdoba, Antioquía, Santander, Caldas, Boyacá, Cundinamarca, Tolima, Valle del Cuca, Cauca, Huila, Nariño, Guaviare y Meta a partir de 1971. Otras fueron adquiridas mediante donaciones de diferentes centros de investigación a nivel mundial, como la Universidad de Wisconsin-Madison, la Universidad de Malaya, la Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria (Embrapa), la Secretaria de Agricultura & Suelos y el Ipea (Brasil), el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, la Universidad de Sídney, la Universidad Estatal de Carolina del Norte y el Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria de Argentina, y un gran número de accesiones son provenientes del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT).