Colección Microbiológica de la Universidad de Nariño

Study Extent

Se tomaron muestras en dos municipios para el departamento de Nariño. Para el municipio de Cumbal, las muestras se aislaron de aguas termales de Baños Chiles. En Pasto, las muestras corresponden de aislamientos de muestras clínicas y colectores de agua. Para las muestras del corregimiento del Encano fueron tomadas del Lago Guamués.

Sampling

Para el aislamiento de aguas termales de Baños Chiles y del Lago Guamués se emplearon recipientes de vidrio estériles y se sumergieron 10 cm en la fuente de agua y llenaron a la mitad del volumen aproximadamente 500 mL y para las muestras del Municipio de Pasto fueron proporcionadas directamente por el Laboratorio Clínico Especializado Ltda y las demás se tomaron en recipientes de vidrio estériles en el colector Juan 23 del Barrio Pandiaco. Para el aislamiento de microalgas de muestras de agua de la Laguna de la Barrosa y Lago Guamués se empleó la metodología por cuadrantes y se tomaron las muestras recipientes de plástico estériles (Van Dorn) y se tomaron en superficie y profundidad aproximadamente 1 Litro de muestra, siguiendo la metodología aplicada por Almanza y colaboradores en el 2016. Para el aislamiento de bateriofagos se emplearon recipientes de vidrio estériles y se sumergieron 10 cm en la fuente de agua y llenaron a la mitad del volumen aproximadamente 500 mL. Para el aislamiento de levaduras y bacterias de muestras de Cacao en el municipio de Sotomayor, las muestras se obtuvieron de fermentaciones de cacao realizadas bajo condiciones artesanales. Se colectaron por triplicado muestras de 500 g de 5 cajones de fermentación. Para obtener cada muestra, se tomaron submuestras a diferentes puntos de profundidad (10, 20, 30 40 y 50 cm) hasta alcanzar los 500 g. El muestreo se realizó a las 24, 48, 72 y 96 horas de fermentación. En total se colectaron 60 muestras que se trasladaron bajo refrigeración al laboratorio de Biotecnología Microbiana de la Universidad de Nariño para continuar con el proceso de aislamiento y obtención de cultivos axénicos.

Method steps

1. Para las muestras de E. coli de origen clínico, inicialmente fueron inoculadas en agar EMB para que resulte en el color característico (verde metálico) de E. coli; las colonias que no presentaron dicha coloración fueron descartadas. Posteriormente, las bacterias confirmadas se inocularon en agar LB para registrar sus características morfológicas, tales como forma, tamaño, color, consistencia, entre otras. De igual forma, se realizaron pruebas bioquímicas tales como TSI, LIA, CS, MRVP, SIM para todas las bacterias aisladas, y las que confirmaron dichas pruebas se identificaron tentativamente como E. coli; consecutivamente se realizó el perfil de resistencia con antibióticos mediante el método de Kirby Bahuer. Posteriormente, se realizó el protocolo de extracción de DNA mediante el kit de extracción de PROMEGA. Se registró la concentración de DNA y su pureza y se ajustó la concentración a 100 μM, se separaron en DNA de Stock y de trabajo; este último fue usado para realizar amplificación de 16S RNA y perfiles de BOX-PCR. Finalmente, las secuencias de DNA se enviaron a MACROGEN para su identificación a nivel molecular. Las secuencias enviadas desde MACROGEN se compararon con secuencias propuestas en bases de datos como GENBANK y confirmar la identificación previa de E. coli.
2. Para las muestras aisladas del colector Juan 23 en sector de Pandiaco, inicialmente fueron cultivadas en agar nutritivo, posteriormente en agar LB y fueron sometidas a diferentes concentraciones de Cromo hexavalente ( Cr (VI)).A continuación, se realizó extracción de DNA cromosomal, se registró la concentración de DNA y su pureza y se ajustó la concentración a 100 μM, se separaron en DNA de Stock y de trabajo; este último fue usado para realizar amplificación de 16S RNA. Finalmente, las secuencias de DNA se enviaron a MACROGEN para su identificación a nivel molecular. Las secuencias enviadas desde MACROGEN se compararon con secuencias propuestas en bases de datos como GENBANK y confirmar la identificación.
3. El aislamiento e identificación de E. coli a partir de muestras de agua del Lago Guamués, se realizó inicialmente a través de medios selectivos, el primero fue agar Chromocult, el cual diferencia entre enterobacterias (colores pálidos) y bacterias fecales (color azul). Posteriormente, Las colonias de color azul se inocularon en medio EMB para que resulte en el color característico (verde metálico) de E. coli; las colonias que no presentaron dicha coloración fueron descartadas. Las bacterias confirmadas se inocularon en agar LB para registrar sus características morfológicas, tales como forma, tamaño, color, consistencia, entre otras. De igual forma, se realizaron pruebas bioquímicas tales como TSI, LIA, CS, MRVP, SIM para todas las bacterias aisladas, y las que confirmaron dichas pruebas se identificaron tentativamente como E. coli .Posteriormente, se realizó el protocolo de extracción de DNA mediante el kit de extracción de PROMEGA. Se registró la concentración de DNA y su pureza y se ajusto la concentración a 100 μM, se separaron en DNA de Stock y de Trabajo; este último fue usado para realizar amplificación de 16S RNA y para realizar perfiles de BOX-PCR. Finalmente, las secuencias de DNA se enviaron a MACROGEN para su identificación a nivel molecular. Las secuencias enviadas desde MACROGEN se compararon con secuencias propuestas en bases de datos como GENBANK y confirmar la identificación previa de E. coli.
4. Para las muestras aisladas de fuente termal del volcán Chiles; se colectaron muestras en 2 puntos seleccionados de las fuentes termales de “Baños Chiles”. Las muestras colectadas manualmente en profundidades entre 15-20 cm en el punto 1 y de la afluente en el punto 2 se depositaron en recipientes plásticos estériles de 3 L por triplicado.Se aplicaron 3 medios de cultivo preparados con agua termal estéril (1.5% w/v) BHI (Cabrera & Díaz, 2003), Luria Bertani (LB, triptona 1%, extracto de levadura 0,5%, NaCl 0,5%, agar 1,5%, pH 7-7,5) y un medio con adición de fuente de carbono (peptona y glucosa). Los procedimientos se realizaron por duplicado, se ajustó pH del medio 7.0 ± 0.1 con NaOH 0.1M y se incubaron durante 72 horas. Posteriormente, se realizó el protocolo de extracción de DNA cromosomal. Se registró la concentración de DNA y su pureza y se ajusto la concentración a 100 μM, se separaron en DNA de Stock y de Trabajo; este último fue usado para realizar amplificación de 16S RNA y para realizar perfiles de BOX-PCR. Finalmente, las secuencias de DNA se enviaron a MACROGEN para su identificación a nivel molecular. Las secuencias enviadas desde MACROGEN se compararon con secuencias propuestas en bases de datos como GENBANK y confirmar la identificación previa de E. coli.
5. Para la obtención de microalgas se siguió la metodología aplicada por Almanza y colaboradores en el 2016 con el fin de abarcar puntos representativos de la laguna Barrosa y el Lago Guamués, tomando muestras de agua a dos profundidades (superficie 1 m y fondo 3 m) en ocho sectores diferentes de la laguna con el fin de abarcar puntos representativos, estableciendo 16 puntos de muestreo en total, la recolección de la muestra de agua se realizó en botella de Van Dorn, con ayuda de peso para garantizar el hundimiento y se pasó a un recipiente previamente estéril y etiquetado con el punto de muestreo. Las muestras se aislaron en medio BG11 modificado y se realizó una caracterización microbiológica y molecular.
6. Para el aislamiento de bacteriofagos se realizó la la metodología propuesta para la detección de los colifagos Norma N° 9211D (American Public Health Association, APHA, 1995). El protocolo inició con la centrifugación de 15 ml de las muestras de agua a 7800 rpm por 30 min. Se realizó una mezcla de 4.5 ml, 1 ml de E. coli y 80 μl de cloruro de trifenil tetrazolium, a la mezcla se le adicionó 5.5 ml del Agar Tripticasa de soya fundido; la mezcla se homogenizó con vórtex y se sirvió en cajas de Petri y se incubó a 37 °C hasta que se observó las placas de lisis. Estos bacteriofagos fueron caracterizados a nivel microbiológico y molecular.
7. Para el aislamiento de levaduras y bacterias de muestras de Cacao en el municipio de Sotomayor se realizó lo siguiente: De cada muestra se trituraron semillas hasta alcanzar 20 g y se mezclaron con 180 mL de agua estéril. Esta solución stock correspondió a la dilución de 10-1 y se realizaron diluciones seriadas hasta 10-6. De cada dilución se inoculó una alícuota de 0,1 mL por el método de siembra en superficie con perlas estériles en medios de cultivo selectivos. De tal forma, para el cultivo de LEV se utilizó agar YGC [extracto de levadura 0.5%, glucosa 2%, cloranfenicol 0.01%], para BAL agar MRS (Man, Rogosa y Sharpe) y para las BAA se modificó el agar DMS (Desoxicolato, Manitol y Sorbitol) [0.1% sorbitol, 0.1% manitol, 0.5% extracto de levadura, 1.5% peptona bacteriológica, 0.5% glucosa, 0.5% etanol, 0.3% ácido acético]. Para la obtención de cultivos axénicos de cada grupo microbiano se utilizó la técnica de agotamiento por estría, el tiempo de incubación se estableció de 48 a 72 h dependiendo el tipo de microorganismo y se mantuvo una temperatura constante de 30 °C. Para los aislados bacterianos se realizó tinción de Gram y prueba de catalasa. Posteriormente, los cultivos axénicos fueron conservados en glicerol en una proporción 1:1 y se almacenaron a -20°C.

Se tienen identificado hasta la categoría de familia 28 virus pertenecientes a las familias Siphoviridae, Microviridae, Myoviridae y Tectiviridae. A nivel de género se ha identificado 5 registros pertenecientes a los géneros Bacillus, Coelastropsis, Nostoc y Paenibacillus. Para la categoría de especie se encontraron 18 especies: Escherichia coli (132 registros), Bacillus licheniformis (11 registros), Bacillus aerius (5 registros), Parachlorella kessleri (2 registros), Acetobacter fabarum, Acetobacter okinawensis, Acetobacter tropicalis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus thuringiensis, Candida glabrata, Candida tropicalis, Desmodesmus subspicatus, Lactiplantibacillus plantarum, Levilactobacillus brevis, Pichia kudriavzevii, Saccharomyces cerevisiae, Scenedesmus obtusus, Tetradesmus obliquus (1 registro).

1. Escherichia coli
   rank: species
2. Bacillus licheniformis
   rank: species
3. Bacillus aerius
   rank: species
4. Parachlorella kessleri
   rank: species
5. Acetobacter fabarum
   rank: species
6. Acetobacter okinawensis
   rank: species
7. Acetobacter tropicalis
   rank: species
8. Bacillus amyloliquefaciens
   rank: species
9. Bacillus thuringiensis
   rank: species
10. Candida glabrata
    rank: species
11. Candida tropicalis
    rank: species
12. Desmodesmus subspicatus
    rank: species
13. Lactiplantibacillus plantarum
    rank: species
14. Levilactobacillus brevis
    rank: species
15. Pichia kudriavzevii
    rank: species
16. Saccharomyces cerevisiae
    rank: species
17. Scenedesmus obtusus
    rank: species
18. Tetradesmus obliquus
    rank: species
19. Siphoviridae
    rank: family
20. Microviridae
    rank: family
21. Tectiviridae
    rank: family

Las muestras fueron tomadas en los municipios de Sapuyes, Sotomayor, Cumbal, Los Andes, Pasto y Lago Guamués- Corregimeinto del Encano, del departamento de Nariño.