Colección Microbiológica de la Universidad de Nariño

Study Extent

Se tomaron muestras en dos municipios para el departamento de Nariño. Para el municipio de Cumbal, las muestras se aislaron de aguas termales de Baños Chiles. En Pasto, las muestras corresponden de aislamientos de muestras clínicas y colectores de agua. Para las muestras del corregimiento del Encano fueron tomadas del Lago Guamués.

Sampling

Para el aislamiento de aguas termales de Baños Chiles y del Lago Guamués se emplearon recipientes de vidrio estériles y se sumergieron 10 cm en la fuente de agua y llenaron a la mitad del volumen aproximadamente 500 mL y para las muestras del Municipio de Pasto fueron proporcionadas directamente por el Laboratorio Clínico Especializado Ltda y las demás se tomaron en recipientes de vidrio estériles en el colector Juan 23 del Barrio Pandiaco.

Method steps

1. Para las muestras de E. coli de origen clínico, inicialmente fueron inoculadas en agar EMB para que resulte en el color característico (verde metálico) de E. coli; las colonias que no presentaron dicha coloración fueron descartadas.Posteriormente, las bacterias confirmadas se inocularon en agar LB para registrar sus características morfológicas, tales como forma, tamaño, color, consistencia, entre otras. De igual forma, se realizaron pruebas bioquímicas tales como TSI, LIA, CS, MRVP, SIM para todas las bacterias aisladas, y las que confirmaron dichas pruebas se identificaron tentativamente como E. coli; consecutivamente se realizó el perfil de resistencia con antibióticos mediante el método de Kirby Bahuer.Posteriormente, se realizó el protocolo de extracción de DNA mediante el kit de extracción de PROMEGA. Se registró la concentración de DNA y su pureza y se ajustó la concentración a 100 μM, se separaron en DNA de Stock y de trabajo; este último fue usado para realizar amplificación de 16S RNA y perfiles de BOX-PCR.Finalmente, las secuencias de DNA se enviaron a MACROGEN para su identificación a nivel molecular. Las secuencias enviadas desde MACROGEN se compararon con secuencias propuestas en bases de datos como GENBANK y confirmar la identificación previa de E. coli.
2. Para las muestras aisladas del colector Juan 23 en sector de Pandiaco, inicialmente fueron cultivadas en agar nutritivo, posteriormente en agar LB y fueron sometidas a diferentes concentraciones de Cromo hexavalente ( Cr (VI)).A continuación, se realizó extracción de DNA cromosomal, se registró la concentración de DNA y su pureza y se ajustó la concentración a 100 μM, se separaron en DNA de Stock y de trabajo; este último fue usado para realizar amplificación de 16S RNA.Finalmente, las secuencias de DNA se enviaron a MACROGEN para su identificación a nivel molecular. Las secuencias enviadas desde MACROGEN se compararon con secuencias propuestas en bases de datos como GENBANK y confirmar la identificación.
3. El aislamiento e identificación de E. coli a partir de muestras de agua del Lago Guamués, se realizó inicialmente a través de medios selectivos, el primero fue agar Chromocult, el cual diferencia entre enterobacterias (colores pálidos) y bacterias fecales (color azul).Posteriormente, Las colonias de color azul se inocularon en medio EMB para que resulte en el color característico (verde metálico) de E. coli; las colonias que no presentaron dicha coloración fueron descartadas. Las bacterias confirmadas se inocularon en agar LB para registrar sus características morfológicas, tales como forma, tamaño, color, consistencia, entre otras. De igual forma, se realizaron pruebas bioquímicas tales como TSI, LIA, CS, MRVP, SIM para todas las bacterias aisladas, y las que confirmaron dichas pruebas se identificaron tentativamente como E. coli.Posteriormente, se realizó el protocolo de extracción de DNA mediante el kit de extracción de PROMEGA. Se registró la concentración de DNA y su pureza y se ajusto la concentración a 100 μM, se separaron en DNA de Stock y de Trabajo; este último fue usado para realizar amplificación de 16S RNA y para realizar perfiles de BOX-PCR. Finalmente, las secuencias de DNA se enviaron a MACROGEN para su identificación a nivel molecular. Las secuencias enviadas desde MACROGEN se compararon con secuencias propuestas en bases de datos como GENBANK y confirmar la identificación previa de E. coli.
4. Para las muestras aisladas de fuente termal del volcán Chiles; se colectaron muestras en 2 puntos seleccionados de las fuentes termales de “Baños Chiles”. Las muestras colectadas manualmente en profundidades entre 15-20 cm en el punto 1 y de la afluente en el punto 2 se depositaron en recipientes plásticos estériles de 3 L por triplicado.Se aplicaron 3 medios de cultivo preparados con agua termal estéril (1.5% w/v) BHI (Cabrera & Díaz, 2003), Luria Bertani (LB, triptona 1%, extracto de levadura 0,5%, NaCl 0,5%, agar 1,5%, pH 7-7,5) y un medio con adición de fuente de carbono (peptona y glucosa). Los procedimientos se realizaron por duplicado, se ajustó pH del medio 7.0 ± 0.1 con NaOH 0.1M y se incubaron durante 72 horas.Posteriormente, se realizó el protocolo de extracción de DNA cromosomal. Se registró la concentración de DNA y su pureza y se ajusto la concentración a 100 μM, se separaron en DNA de Stock y de Trabajo; este último fue usado para realizar amplificación de 16S RNA y para realizar perfiles de BOX-PCR. Finalmente, las secuencias de DNA se enviaron a MACROGEN para su identificación a nivel molecular. Las secuencias enviadas desde MACROGEN se compararon con secuencias propuestas en bases de datos como GENBANK y confirmar la identificación previa de E. coli.

Se tienen identificado hasta la categoría de género 3 registros pertenecientes a los géneros Bacillus y Paenibacillus. Para la categoría de especie se encontraron cinco especies: Escherichia coli (132 registros), Bacillus licheniformis (11 registros), Bacillus aerius (5 registros), Bacillus amyloliquefaciens y Bacillus thuringiensis (1 registro).

1. Escherichia coli
   rank: species
2. Bacillus licheniformis
   rank: species
3. Bacillus aerius
   rank: species
4. Bacillus amyloliquefaciens
   rank: species
5. Bacillus thuringiensis
   rank: species

Las muestras fueron tomadas en los municipios de Cumbal, Pasto y Lago Guamués- Corregimeinto del Encano, del departamento de Nariño