Cambios ultraestructurales de células espermáticas de capitán de la sabana Eremophilus mutisii sometidas a criopreservación

Study Extent

Represa del Sisga, municipio Chocontá.

Sampling

Los ejemplares serán muestreados acogiendo los protocolos de manejo ético de animales en lo referente a sujeción, sedación y toma de muestras de acuerdo a lo establecido en The International Council for Laboratory Animal Science (Close et al., 1997). Los ejemplares serán transportados en cajas plásticas con buena calidad y cantidad de agua, en vehículos acondicionados hasta las instalaciones de la U.D.C.A. Con el fin de lograr la domesticación de los peces, se adecuarán tanques plásticos de 250 y 500 litros para su mantenimiento adecuado.Una vez acondicionados los peces, serán acostumbrados al consumo de dietas secas mediante el suministro de alimento balanceado comercial para peces, con un nivel proteico de 38% de PB y un tasa alimenticia del 2% del peso vivo, distribuido en dos raciones diarias. Los pescadores de la región, son personas experimentadas en la captura de estos especímenes, utilizando como arte de pesca anzuelo y como carnada lombriz de tierra.

Quality Control

Para evaluar la eficiencia de las soluciones crioprotectoras, los resultados de la Motilidad, se analizarán bajo un diseño en Bloques al azar con 6 soluciones crioprotectoras (DMSO, DMSO + Yema, DMA, DMA + Yema, ETANOL, ETANOL + Yema) y 3 diferentes tiempos de almacenamiento (1 día, 1 mes y 1 año), además de un tratamiento control (semen fresco). La información obtenida será expresada a través de estadística descriptiva. Los datos obtenidos serán analizados a través de análisis de varianza de dos factores (ANOVA convencional o prueba de Kruskal-Wallis, según los datos resulten paramétricos o no paramétricos, respectivamente), seguido de la prueba de Tukey cuando se requiera, según el caso. En todos los casos, p<0,05 será utilizado como criterio estadístico para revelar diferencias significativas. Antes de las evaluaciones se probará la robustez de los modelos mediante pruebas de Bartlet, para determinar la homogeneidad de varianza, y de Kolmogorov - Smirnov, para garantizar la normalidad de los datos.

Method steps

1. Colecta de semen Ejemplares de Eremophilus mutisii machos adultos y maduros sexualmente (que liberen semen al realizar presión hacia la papila urogenital) serán seleccionados del plantel de reproductores y mantenidos en tanques plásticos de 500 litros con temperatura promedio de 15 grados centígrados. La eyaculación será estimulada aplicando Extracto de Pituitaria de Carpa (EPC) en una única aplicación intramuscular correspondiente a 4 mg de EPC/Kg de peso del reproductor. Transcurridas 24 horas, los animales serán anestesiados con MS-222 a una concentración de 200 ppm hasta que el animal alcance el estado profundo de anestesia, esto con el objetivo de minimizar el estrés del animal y garantizando el bienestar animal. Posteriormente los animales serán sometidos a masajes abdominales en sentido cráneo-caudal para estimular la liberación del semen. Los animales deben estar completamente secos en la región abdominal para evitar contaminaciones con materia fecal y/o orina y evitar la activación espermática por contacto con agua.
   Criopreservación de Semen De por lo menos 10 machos, será colectado el semen para formar un “pool” para la realización de los experimentos. Cada una de las 3 soluciones crioprotectoras serán preparadas y homogeneizadas con el “pool” de semen, Las 3 muestras serán mantenidas en reposo por 10 minutos a temperatura ambiente y protegidas de la luz. Posteriormente, se tomarán 10uL de cada muestra y se activará con 100uL de agua destilada, para evaluar la motilidad espermática (% y duración). Serán utilizadas 6 soluciones crioprotectoras así: Diluyente 1: Dimetilsulfoxido (DMSO) (10%) + Yema de Huevo de Gallina (6%) + Glucosa (6%). Diluyente 2: Dimetilsulfoxido (DMSO) (10%) + Glucosa (6%). Diluyente 3: Metanol (10%) + Yema de Huevo de Gallina (6%) + Glucosa (6%). Diluyente 4: Metanol (10%) + Glucosa (6%). Diluyente 5: Dimetil Acetamida (DMA) (8%) + Yema de Huevo de Gallina (6%) + Glucosa (6%) Diluyente 6: Dimetil Acetamida (DMA) (8%) + Glucosa (6%) Las soluciones crioprotectoras serán preparadas una hora antes de la dilución con el semen para que haya estabilización de los crioprotectores y término de las reacciones exotérmicas perjudiciales a las células espermáticas. El “pool” de semen será adicionado en cada solución crioprotectora en proporción 1:6 (v/v, semen : solución crioprotectora) y posteriormente, por aspiración, será envasado en pajillas de 0,5 mL. Las pajillas serán colocadas en “raks” y almacenadas en termo de vapor de nitrógeno, durante 1 hora, posteriormente, las pajillas serán trasladadas a un termo de nitrógeno líquido de almacenamiento, donde permanecerán durante 1 día, 1 mes y 6 meses. Después de cada uno de los tres tiempos de conservación, las pajillas serán descongeladas a 30 grados centígrados durante 10 segundos en las cuales será evaluada la motilidad de cada una de ellas, siguiendo el protocolo descrito anteriormente y de cada solución criopreservante. Al día 1, día 30 y día 180, será tomada una pajilla descongelada, para fijarla y procesarla en la rutina de microscopia Electrónica de Transmisión, con el fin de evaluar las posibles malformaciones en los espermatozoides ocasionadas por las soluciones criopreservantes y por el tiempo de congelación.

Pez, nombre común Capitán de la Sabana Familia:Trychomicteridae Genero:Eremophilus Especie: Eremophilus mutisii

1. Eremophilus mutisii
   common name: Capitán de la Sabana rank: species

Represa del Sisga, municipio Chocontá.