Línea base general de microorganismos para el valle medio del Magdalena - VMM

Study Extent

La caracterización de la biodiversidad de los microorganismos en los Proyectos Piloto de Investigación Integral - PPII sobre Yacimientos No Convencionales de hidrocarburos -YNC para las áreas priorizadas de los proyectos Kale y Platero, y sus áreas circundantes, se realizó en dos temporadas (aguas altas-medias, aguas bajas-altas) climáticas a partir de las comunidades presentes en suelos, sedimentos, aguas subterráneas y superficiales, tanto en sistemas lénticos como lóticos. total, incluimos por temporadas 125 unidades de muestreo: 36 en suelos, 9 en agua subterránea temporada de aguas altas, 10 en aguas subterráneas temporada de aguas bajas, 40 en agua superficial, y 40 en sedimentos.

Sampling

1. Toma de muestras en campo: En aguas superficiales se tomaron subterráneas 3 muestras de 1 litro por pozo o aljibe seleccionado, en aguas 3 muestras de 1 litro distanciadas aproximadamente 50 m un transecto de por lo menos 100 m de longitud, en sedimentos 3 muestras de 250 g distanciadas aproximadamente 50 m un transecto de por lo menos 100 m de longitud, en suelo 3 muestras de 900 g en 3 cuadrantes de un área aproximada de 900 m2. Para aguas superficiales y subterráneas medición de parámetros fisicoquímicos en cada lugar de muestreo, y en el caso de suelos y sedimentos medición de pH de cada muestra en el laboratorio. Todas las muestras fueron mantenidas refrigeradas con hielo hasta el momento de la extracción de ADN. 2. Filtración de muestras de agua utilizando filtros de 0.45 micras para aguas superficiales y 0.22 para aguas subterráneas 3. Preparación de controles de extracción y filtración en el caso de de agua superficial y subterráneas. 4. Extracción de ADN utilizando el kit de de extracción NucleoSpin Soil (Macherey-Nagel) y siguiendo especificaciones del fabricante. 5. Elución de las muestras y medición de concentraciones para envío al servicio de preparación de librerías y secuenciación de alto rendimiento. 6. Secuenciación de alto rendimiento utilizando un NovaSeq PE250 (Illumina). Las regiones a amplificar fueron 16S (V3-V4) para bacteria, 16S (V4-V5) para arqueas, ITS1 para hongos, y 18S (V7) para eucariotas. 7. Demultiplexación (asignación de secuencias a muestra) y control de calidad de las secuencias obtenidas. 8. Flujo bioinformático para detectar errores de secuenciación, quimeras y asignación taxonómica, utilizando el programa QIIME2 versión 2021.11 (Bolyen et al 2019) y el flujo de trabajo DADA2 en QIIME2 (Callahan et al., 2016). 9. Limpieza y filtrado de secuencias agrupadas por ASVs en R. 10. Ubicación de archivos crudos: NAS del Instituto de Investigaciones Alexander von Humboldt. Los datos se encuentran depositados temporalmente en un disco duro externo ubicado en el Instituto Alexander von Humboldt, en las carpetas http://190.25.232.2:780/cgi-bin/Microorganismos/Metabarcoding/ANH2/, y http://190.25.232.2:780/cgi-bin/Microorganismos/Metabarcoding/ANH3/. Dentro de esta carpeta, se ubican las carpetas correspondientes a cada grupo (bacterias, arqueas, hongos, y eucariotas). En cada carpeta se encuentran alrededor de 1.260 archivos correspondientes a las réplicas por PCR de cada réplica biológica procesada por punto de muestreo y controles. Los archivos son nombrados de acuerdo a la unidad de muestreo y el tipo de sustrato analizado (ej. ANH1_SU61_1_R1, donde ANH es el proyecto, temporada 1 ANH1, temporada 2 ANH2, SU es el tipo de sustrato, SU: suelos, A: aguas superficiales, AS: aguas subterráneas, SE: sedimentos, numero la unidad de muestreo, numero sub muestra R1: réplica de PCR).

Quality Control

Se incluyen 10 controles positivos, 34 controles de extracción, 32 controles de filtración y 11 blancos de PCR. Las secuencias crudas se han asignado a sus respectivas muestras y ningún procesamiento bioinformático adicional se ha llevado a cabo. En caso de ser usadas, deben realizarse el tratamiento con todos pasos de filtración y depuración que se implementaron en el procesamiento bioinformático.

Method steps

1. Muestreo en campo: La toma de muestras en campo se realizó en suelo, aguas superficiales, aguas subterráneas y sedimentos. En cada uno de los lugares donde se realizó la toma de muestras se tomaron datos fisicoquímicos in situ. Una vez las muestras estuvieron en el laboratorio se realizó la extracción de ADN. Para asegurar la calidad de las muestras, preservamos estas a baja temperatura (alrededor de 4 ºC) usando una nevera con hielo, desde el momento de su recolección hasta su procesamiento y extracción de ADN en la estación de trabajo. Durante la toma, manipulación y procesamiento de las muestras, usamos guantes y tapabocas desechables, los cuales fueron reemplazados entre muestras. Igualmente, esterilizamos todos los elementos y equipos usados en la toma, manipulación y procesamiento de muestras a través de flameo con alcohol al 96% o inmersión en hipoclorito al 10%, y/o los reemplazamos entre unidades de muestreo, para disminuir el riesgo de contaminación. Análisis Fisicoquímicos in situ: El muestreo in situ se refiere a la estimación de parámetros tales como temperatura (°C), pH, conductividad (µS/cm), sólidos disueltos totales (mg/L), porcentaje de oxígeno disuelto (%), oxígeno disuelto (mg/L), y resistividad (kohm/cm), directamente en el sitio de muestreo durante la recolección de las muestras de agua superficial y subterránea. Los parámetros fisicoquímicos se midieron utilizando las sondas multiparamétricas HANNA HI98194 y HI9829. El porcentaje de oxígeno disuelto y el oxígeno disuelto se midieron en aguas superficiales, mientras que la resistividad se midió exclusivamente en aguas subterráneas. En el caso de suelo y sedimento, el único parámetro estimado in situ fue el pH. El pH se estimó considerando una relación de suelo o sedimento/agua de 1:10, tomando un gramo de suelo o sedimento y disolviéndolo en 9 mL de agua destilada. Esta solución fue agitada manualmente por 15 segundos y posteriormente homogenizada en un mezclador rotativo por 15 minutos. A partir de esta mezcla, se determinó el pH con un pHmetro HANNA HI98190. Este procedimiento fue aplicado para cada una de las tres muestras de suelo y sedimento recolectadas por unidad de muestreo. Procesamiento de muestras de agua superficial y subterránea: Procesamos las muestras de agua, tanto superficiales como subterráneas, dentro de las 24 horas siguientes a su recolección. El procesamiento inició con el filtrado de cada litro de agua usando filtros de nitrato de celulosa en un sistema de filtración múltiple (manifold) conectado a dos bombas de vacío. Los filtros saturados eran retirados del sistema y almacenados en un tubo plástico estéril de 50 mL. Todos los filtros usados para cada muestra fueron depositados en un único tubo, que conservamos a 4ºC hasta el momento de su extracción de ADN. Para el agua superficial usamos filtros con tamaño de poro de 0.45 µm, mientras que para agua subterránea usamos filtros de 0.22 µm. Una vez terminada la filtración de cada muestra, esterilizamos todos los elementos del sistema que entraron en contacto con la muestra a través de inmersión completa en una solución de hipoclorito al 10% por al menos 15 min, con un lavado posterior con abundante agua destilada. Por cada evento de filtración incluimos un control de filtrado, que correspondió a los filtros resultantes del filtrado de 1 L de agua destilada. En total, generamos 18 controles de filtración, que fueron procesados como una muestra en los procesos posteriores. Procesamiento de muestras de sedimento y suelo: De las muestras de suelo y sedimentos, inicialmente homogeneizadas, extrajimos 0.5 g que se depositaron en tubos plásticos con perlas de cerámica (MN Bead Tube Type A) del kit comercial de extracción de ADN NucleoSpinTM Soil de Macherey-NagelTM. Procesamos todas las muestras dentro de las 24 horas siguientes a su recolección, manteniéndolas refrigeradas a 4ºC hasta el momento de la extracción de ADN. Extracción de ADN: Realizamos la extracción de ADN dentro de las 24 horas siguientes a la toma de las muestras, y usando, para todas las muestras (agua, suelo y sedimentos), el kit NucleoSpinTM Soil de Macherey-NagelTM de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. Para las muestras de agua, los filtros almacenados en los tubos de 50 ml fueron tratados con 10 a 15 mL de una solución tampón de fosfato saturado (Na2HPO4; 0.12 M; pH ≈ 8). Esta solución tampón tiene la finalidad de romper los puentes que adhieren el ADN a los filtros (Taberlet et al., 2018). Una vez añadida la solución tampón a los filtros, estos fueron agitados manualmente por 15 segundos y mezclados en un mezclador rotativo por 15 minutos. De la suspensión de ADN resultante, tomamos 500 µL que depositamos en los tubos con perlas de cerámica del kit de extracción. Una vez todas las muestras (agua, suelo y sedimentos) estuvieron en los tubos con perlas de cerámica, añadimos 700 µl del buffer de lisis SL1 y 150 µl del reactivo Enhancer SX. Homogeneizamos las muestras manualmente por 15 segundos y centrifugamos a 11000g por 2 minutos con el fin de precipitar los contaminantes. Luego, agregamos 150 µl de la solución SL3 para precipitar los contaminantes, agitamos con vórtex por 5 segundos, incubamos a 0ºC por 5 minutos, y centrifugamos a 11000g por 1 minuto. Posteriormente, esta solución pasó a través de las columnas de anillo rojo para remover inhibidores de PCR y posteriormente centrifugadas a 11000g por 1 minuto. Recolectamos el sobrenadante en un tubo de 2 mL. En el caso de agua subterránea, agua superficial y sedimentos, realizamos los primeros pasos de la extracción por duplicado para aumentar la concentración final de ADN. Para la unión del ADN a la columna de sílice y el lavado de las columnas utilizamos el equipo QIAvac 24 Plus, que es un sistema de vacío para columnas de extracción de ADN. Primero, el sobrenadante de cada una de las muestras pasó por la columna de sílice, que posteriormente fue lavada con 500 µl del reactivo SB, 550 µl de SW1, 700 µl de SW2, y finalmente con 700 µl de SW2, usando una pipeta repetidora. Para finalizar, centrifugamos a máxima velocidad las columnas por 3 minutos para secarlas, garantizando una mayor estabilidad y conservación del ADN. El ADN fue preservado en la columna de sílice en seco, en un tubo de centrífuga estéril de 1.5 mL sin tapa. La columna de sílice dentro del tubo fue sellada con papel parafinado y almacenada en condiciones de temperatura estable y sin exposición a luz con silicagel como indicador de humedad y para mantener las muestras secas. Por cada evento de extracción incluimos controles de extracción, para un total 18 controles de extracción que fueron procesados igual que las muestras de suelo, agua, y sedimento. La concentración de ADN fue cuantificada por fluorescencia utilizando un equipo Qubit 4 con un kit de análisis de ADN de alta sensibilidad (Invitrogen dsDNA HS). Este es un sistema de cuantificación que se basa en colorantes que solo emiten fluorescencia cuando se unen a moléculas específicas como el ADN. Para esta cuantificación el equipo fue calibrado utilizando un rango de ensayo declarado entre 0,01 y 100 ng/µL. Para cada muestra de ADN 1 µL fue adicionado a 199 µL de solución de trabajo, posteriormente agitado con un vórtex por 15 segundos, e incubado por 2 minutos a 4°C. Preparación de librerías de secuenciación: La preparación de librerías para metabarcoding implicó dos rondas de amplificación. La primera ronda de amplificación consistió en amplificar la región de ADN que permitió la identificación de las unidades taxonómicas moleculares con cebadores específicos para cada grupo. La segunda ronda de amplificación consistió en incluir los índices y adaptadores en los productos amplificados que permitieron que la secuenciación masiva pudiera llevarse a cabo y demultiplexar las diferentes librerías. Para bacterias se amplifico la región 16S (V3-V4) del ARN ribosomal de alrededor de 300 pb. Para esta región se utilizaron los cebadores 341F (5 'CCT ACG GGA GGC AGC AG 3') y 806R (5 'GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT 3'). Para arqueas se amplificó un fragmento de la región de ARNr 16S (V4-V5) de alrededor de 420 pb utilizando los cebadores Arch519f (5'CAG CCG CCG CGG TAA 3 ') y Arch915r (5' GTG CTC CCC CGC CAA TTC CT 3 '). En hongos se amplificó un fragmento de 200 pb del espaciador transcrito interno 1 (ITS1) del ARN ribosomal, utilizando los cebadores ITS5 (5 'GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G 3') y 5.8S_fungi (5 'CAA GAG ATC CGT TGT TGA AAG TK 3 ') (Epp et al., 2012). Finalmente, para eucariotas se amplifico la región 18S (V7) del ARN ribosomal de alrededor de 100 pb utilizando los cebadores 18S_allshorts-F (5 'TTT GTC TGS TTA ATT SCG 3') y 18S_allshorts-R (5 'CAC AGA CCT GTT ATT GC 3'). Las amplificaciones se llevaron a cabo por triplicado en un volumen final de 12,5 μL, que contenía 1,25 μL de ADN molde, 0,5 μM de los cebadores, 3,25 μL de Supreme NZYTaq 2x Green Master Mix (NZYTech) y agua ultrapura hasta 12,5 μL. En bacterias, la amplificación se realizó bajo las siguientes condiciones: un paso de desnaturalización inicial a 95 ºC durante 5 min, seguido de 25 ciclos de 95 ºC de desnaturalización durante 30 s, 45 ºC de hibridación durante 45 s, 72 ºC de extensión durante 45 s, y un paso de extensión final a 72 ºC durante 7 min. Para arqueas: un paso de desnaturalización inicial a 95 ºC durante 5 min, seguido de 35 ciclos de 95 ºC durante 30 s, 57 ºC durante 45 s, 72 ºC durante 45 s, y un paso de extensión final a 72 ºC durante 7 min. En hongos: un paso de desnaturalización inicial a 95 ºC durante 5 min, seguido de 35 ciclos de 95 ºC durante 30 s, 57 ºC durante 45 s, 72 ºC durante 45 s, y un paso de extensión final a 72 ºC durante 7 min En eucariotas: un paso de desnaturalización inicial a 95 ºC durante 5 min, seguido de 35 ciclos de 95 ºC durante 30 s, 57 ºC durante 45 s, 72 ºC durante 45 s, y un paso de extensión final a 72 ºC durante 7 min. Para verificar la contaminación durante la preparación de las librerías se incluyó un control negativo por ronda de PCR que no contenía ADN. Los índices se unieron a los productos de PCR. obtenidos en la primera ronda de amplificación, bajo condiciones de PCR idénticas, pero solo 5 ciclos y una temperatura de hibridación de 60 ºC. Las librerías se comprobaron en geles de agarosa al 2% coloreadas con GreenSafe (NZYTech) y se obtuvieron imágenes bajo luz ultravioleta para verificar el tamaño de las librerías. Las librerías se purificaron utilizando perlas magnéticas Mag-Bind RXNPure Plus (Omega Biotek), siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Luego, las librerías se combinaron en cantidades equimolares de acuerdo con los datos de cuantificación proporcionados por el ensayo Qubit dsDNA HS (Thermo Fisher Scientific). El conjunto de librerías se secuenció en una fracción del carril NovaSeq PE250 (Illumina). Los datos de secuenciación sin procesar utilizando tecnología Illumina paired-end consiste en lecturas directas (R1) e inversas (R2) ordenadas por librerías y sus correspondientes puntuaciones de calidad. La preparación y secuenciación de las librerías fue realizada por AllGenetics & Biology SL (www.allgenetics.eu). Procesamiento bioinformático: Se analizaron 2520 archivos de secuencias crudas de-multiplexadas, sin adaptadores, cebadores, e índices tanto para cada grupo. Del total de archivos 2259 corresponden a suelos (648), sedimentos (720), aguas superficiales (720), y aguas subterráneas (171), y 261 corresponden a controles de extracción, filtración, positivos y blancos de PRC. La calidad de las secuencias genéticas fue comprobada utilizando el programa FASTQC (Andrews, 2010), y se descartaron secuencias con calidades inferiores a un valor de 20. Los extremos de las secuencias fueron recortados en aquellos casos donde presentaran un valor de calidad inferior a 20 (Li et al. 2004). Las secuencias pair-end sin procesar se importaron a QIIME2 (versión 2021.11, Bolyen et al 2019) usando la opción QIIME tools import. Se utilizó el software DADA2 implementado en QIIME2 para obtener un conjunto de variantes de secuencia observadas, en inglés amplicon sequences variants - ASV (Callahan et al., 2016) equivalentes a unidades taxonómicas. DADA2 se basa en un modelo parametrizado de errores de sustitución para distinguir los errores de secuenciación de la variación biológica real, y utiliza un algoritmo de corrección de errores de secuencia de Illumina para generar una distribución de variantes de secuencias distintos, que pueden diferir en un solo nucleótido. Para este procedimiento se utilizó la opción QIIME dada2 denoise-paired. Debido a que las secuencias presentaron una excelente calidad, estas no fueron truncadas. Se descartaron todos los ASV que tuvieran una abundancia mínima del 1% “singletons” en todas las muestras. La asignación taxonómica de los ASV se generó utilizando la función QIIME feature-classifier classify-sklearn, con un clasificador Naïve Bayes entrenado en la base de datos SILVA, versión 138 (Quast et al., 2012), para bacterias y arqueas, PR2, v.4.14.0, para eucariota y en el caso de hongos se descargaron las secuencias del GenBank utilizando la siguiente búsqueda: txid4751[ORGN] AND (internal transcribed spacer 1 AND 5.8S ribosomal AND internal transcribed spacer 2). Las variantes de secuencia que se clasificaron como cloroplasto y mitocondria se eliminaron del análisis. Posteriormente se realizaron procesos de selección y eliminación de: 1. ASV que tuvieron un porcentaje de asignación menor al primer cuartil para cada uno de los grupos de estudio (bacterias < 0,86%, arqueas < 0,85%, hongos < 0.85%, y eucariotas < 0,87), 2. ASV asignados exclusivamente a cada grupo de estudio, 3. ASV contaminantes y PCR con un porcentaje mayor al 10% de ASV contaminantes, 4. PCR con un número de secuencias inferior a la mitad del primer cuartil, 5. ASV únicos para cada PCR, 6. ASV que pueden ser generados debido al salto de etiquetas y la contaminación implicadas en la preparación de las entre librerías, y 7. Remoción de controles de extracción, filtración, blancos de PCR, y controles positivos. Todos estos procedimientos fueron realizados en R (R Core Team 2022) modificando las funciones de la libreria MetabaR (Zinger et al., 2021) para la librería physeq (McMurdie y Holmes, 2013)

En estos datos se presenta la información obtenida a partir de secuenciación de alto rendimiento para 4 grupos biológicos: bacterias, arqueas, hongos, y eucariotas. Para la asignación taxonómica se utilizó el método de clasificación Naive bayes classifier. Las bases de datos de comparación fueron, en el caso de bacterias y arqueas, SILVA v138.1, en hongos se descargaron las secuencias del GenBank basado en la siguiente búsqueda: txid4751[ORGN] AND (internal transcribed spacer 1 AND 5.8S ribosomal AND internal transcribed spacer 2), fecha de descarga: 2022-05-0, y para eucariotas se utilizó la base de datos PR2 v.4.14.0. La asignación taxonómica de las secuencias filtradas y depuradas estuvo entre 99% a un 95% dependiendo del grupo. Para todos los grupos la cobertura taxonómica se registra a nivel de Phylum, Clase, Orden, Familia, Género y Especie, y se registra el porcentaje de asignación a cada grupo por muestra. En bacterias la asignación taxonómica para cada cobertura taxonómica fue en promedio la siguientes: de Phylum 99%, Clase 99%, Orden 98%, Familia 97%, Género 82% y Especie 60%. En arqueas el porcentaje de asignación taxonómica fue: Phylum 98%, Clase 98%, Orden 95%, Familia 91%, Género 90% y Especie 72%. En hongos se observó el siguiente porcentaje de asignación taxonómica por coberturas: Phylum 67%, Clase 66%, Orden 65%, Familia 63%, Género 54% y Especie 49%. Y en eucariotas el porcentaje de asignación taxonómica por cobertura fue: Phylum 74%, Clase 71%, Orden 58%, Familia 57%, Género 49% y Especie 26%.

1. Bacteria
   rank: domain
2. Archaea
   rank: domain
3. Eukaryota
   rank: domain
4. Fungi
   rank: kingdom

El área de estudio propuesta para Guane-Kalypso y Platero, se encuentra ubicada principalmente en el departamento de Santander en los municipios de Puerto Wilches, Barrancabermeja, Sabana de Torres. Con influencia también en el departamento de Bolívar en los municipios de Cantagallo y San Pablo, así como en el departamento de Antioquia en el municipio de Yondó. Esta área de estudio es de aproximadamente 178.958 ha