Caracterización morfológica de hongos de suelo, agua y sedimentos del Magdalena Medio y Piedemonte Casanare - Proyecto FIBRAS

Study Extent

Los aislamientos fueron obtenidos de muestras ambientales (suelo, agua y sedimento) de los núcleos de Magdalena Medio y Piedemonte Casanare, en los departamentos de Santander (municipios de El Carmen del Chucurí, Barrancabermeja y San Vicente de Chucurí), y Casanare (municipios de Aguazul y Tauramena). Dentro de cada núcleo se seleccionaron áreas que incluyeran dos niveles (alta y baja) de concentración de crudo y de huella humana; con tres réplicas por combinación de factores. Para capturar la heterogeneidad espacial de cada núcleo, se escogieron al menos tres sitios de estudio y tres réplicas en cada tratamiento separadas entre sí por más de 3 km para garantizar la independencia estadística de los análisis. En Magdalena Medio se eligieron 12 sitios de muestreo, con todos los tratamientos de análisis, y tres réplicas en cada tratamiento; mientras que en Piedemonte Casanare se eligieron 9 sitios de muestreo, ya que no se identificaron sitios con baja huella humana y presencia de crudo.

Sampling

En cada sitio se implementó un diseño por bloques para la recolección de tres muestras ambientales: agua, suelo y sedimento. En cada punto, se delimitó una cruz y en cada extremo de la cruz se tomó una submuestra de suelo, a 10 cm de profundidad y un metro de distancia del centro. Cada muestra de suelo estuvo compuesta de la mezcla de cuatro submuestras, para un total de alrededor de 500 g de suelo. En el caso de aguas y sedimentos, se realizó un trayecto de 20 metros, y se tomó una sub-muestra, iniciando en un extremo, cada 10 metros. En total para cada sitio se recolectaron 500 g de sedimento y 3 litros de agua. De estas muestras se tomaron submuestras para realizar diluciones seriadas y realizar el aislamiento de hongos. De estos, se seleccionaron 300 aislamientos para la identificación a partir de caracteres macro y microscópicos morfológicos. El proceso es descrito en la sección Metodología Paso a Paso.

Method steps

1. Aislamiento de hongos en suelo y sedimento: Se pesaron 11 g de suelo o sedimento y se suspendieron en 99 mL de agua destilada estéril, para después ser llevada a vórtex por 10 minutos para garantizar que los propágulos fúngicos se desprendan de la muestra. A partir de esta primera dilución (10-1), se hicieron diluciones seriadas hasta 10 5 y se inocularon 100 μL en superficie, por extensión de las diluciones 10-1, 10-3 y 10-5, por triplicado, en cajas de Petri con Agar Papa Dextrosa (PDA) y Agar Rosa Bengala (RB), ambos suplementados con cloranfenicol al 0,05% p/v.
2. Aislamiento de hongos en agua: Mediante un sistema de filtración al vacío se procesaron 500 mL de las muestras de agua usando un embudo Büchner estéril y un papel filtro Whatman No. 1 estéril. Los 500 mL de agua fueron filtrados en dos fracciones de 250 mL cada una, de lo cual se obtuvieron dos filtros (réplicas). Estos fueron depositados en cajas de Petri con PDA suplementado con cloranfenicol al 0,05% p/v con la superficie.
3. Purificación de los aislamientos fúngicos: Con base en la descripción original de los aislamientos seleccionados, se tomó un inóculo de la colonia más aislada (correspondiente con la morfología descrita para cada aislamiento) y se sembró en cajas de Agar Papa Dextrosa (PDA) mediante un agotamiento. Esta técnica permite separar colonias de microorganismos que estén creciendo en el mismo medio con el fin de obtener colonias aisladas.
4. Mantenimiento de los aislamientos fúngicos: Para mantener los aislamientos fúngicos metabólicamente activos y libres de microorganismos contaminantes cada dos semanas se hicieron subcultivos en cajas de PDA siguiendo los protocolos de bioseguridad en laboratorio.
5. Descripción morfológica e identificación taxonómica: Se observaron y describieron los aislamientos fúngicos, tomando en consideración las características morfológicas macroscópicas (e.g. tamaño de la colonia, apariencia del micelio, color de la colonia por el anverso, color de la colonia por el reverso, pigmento al medio) y microscópicas (e.g. características del micelio, estructuras reproductivas sexuales o asexuales). A partir de esta información, se llevó a cabo la identificación taxonómica tradicional, soportada por artículos científicos, libros, guías de identificación y claves taxonómicas (Carmichael et al 1980, Barnett y Hunter 1998, Klich 2002, Watanabe 2002, Samson et al 2004, Cepero et al 2012, Samuels y Hebbar 2015, Crous et al 2021).
6. Conservación de los aislamientos fúngicos: Los aislamientos obtenidos se conservaron en agua estéril, siguiendo el protocolo de Burdsall & Dorworth (1994) y Ayala-Zermeno et al. (2017) con algunas modificaciones. Los hongos fueron subcultivados en cajas de PDA e incubados por siete días o hasta alcanzar un diámetro de 30 mm. De estos cultivos frescos se tomaron seis a ocho plugs de micelio de 5 mm de diámetro. Los plugs fueron depositados en frascos de vidrio con 5 mL de agua estéril. Posteriormente, los viales se cerraron con tapones de caucho y se sellaron con agrafes de aluminio. Cada frasco se rotuló con el código del aislamiento, la fecha de preservación y el nombre del proyecto i.e. FIBRAS. Los hongos conservados se almacenaron en un lugar fresco y seco a temperatura ambiente.

Los 300 aislamientos comprenden 34 taxones diferentes del Reino Fungi. Las jerarquías taxonómicas hasta las que fue posible la identificación morfológica incluye desde filo (36), clase (2), órden (24), hasta familias (41) y género (197).

1. Ascomycota
   rank: phylum
2. Basidiomycota
   rank: phylum
3. Mucoromycota
   rank: phylum

Los aislamientos provienen de 35 puntos diferentes de los núcleos de Magdalena Medio y Piedemonte Casanare, comprendiendo los municipios de El Carmen de Chucurí, Barrancabermeja y San Vicente de Chucurí en el departamento de Santander, y los municipios de Aguazul y Tauramena en el departamento de Casanare, Colombia.