Biodiversidad identificada por medio de metabarcoding asociada al proyecto piloto de investigación integral - PPII Platero, departamento de Santander

Study Extent

El presente estudio fue llevado a cabo en el occidente del departamento de Santander, en la provincia de Yariguíes, situada en el valle medio del río Magdalena, en los corregimientos El Centro, El Pedral, Kilometro 8, Puente Sogamoso, y las veredas Bocas de Sogamoso del municipio de Puerto Wilches.

Sampling

Para capturar la variabilidad del sistema biológico en cada sitio, se tomó un número de réplicas representativo de la heterogeneidad del área. La selección del número y ubicación de las réplicas biológicas se hizo luego de estructurar un diseño experimental entre los diferentes grupos biológicos, y fue refinado en una pre-salida de calibración. Para capturar la variabilidad, se tomaron al menos 3 muestras en cada punto de monitoreo biológico de agua y sedimento. La metodología se basa en el Protocolo para la toma de muestras ambientales de agua, sedimento, suelo y extracción de ADN para metabarcoding, propuesto por la Agencia Nacional de Hidrocarburos – ANH y el Instituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt – IavH.

Method steps

1. La metodología para el muestreo de microorganismos se dividio en muestras de agua, sedimento y suelo.
2. Muestras de agua: Se contempló una unidad de muestreo compuesta de tres muestras simples, tomadas a lo largo de un transecto en el cuerpo de agua según el tamaño de este. Para el caso de los sistemas lóticos, las muestras se tomaron desde la réplica ubicada más aguas abajo del transecto definido, en dirección contraria al flujo, para evitar perturbar el agua y modificar las condiciones de esta. Para la toma de cada muestra, se tomó 1 litro de agua superficial usando un recipiente previamente esterilizado y usando guantes y tapaboca limpios. Se almacenó inmediatamente a baja temperatura (4°C), usando una nevera con hielo. En el caso de sistemas lénticos, se tomaron las tres réplicas de cada punto definido de forma equidistante tratando de cubrir un área representativa del cuerpo de agua. Una vez recolectadas las muestras, se procedió a hacer el filtrado de éstas en una estación diseñada para tal fin. Se usaron filtros de nitrato de celulosa con un tamaño de poro de 0.45 µm, los cuales se ajustaron a un sistema de filtrado múltiple tipo Manifold. Una vez terminado el proceso de filtración, los filtros fueron almacenados en tubos Falcon de 50ml y se preservaron con etanol al 96%. Finalmente, las muestras se guardaron en un congelador para ser enviadas al laboratorio molecular encargado de hacer la extracción del ADN y su respectiva secuenciación.
3. Muestras de sedimento: Al igual que para aguas, se determinó una unidad o punto de muestreo compuesta de tres muestras simples, tomadas a lo largo de un transecto definido. Las muestras de sedimento se colectaron en el mismo lugar de toma de muestras de aguas superficiales. Las muestras de sedimento se tomaron con paladraga o draga según la profundidad y tipo de sustrato del ecosistema monitoreado, se colectó sedimento de al menos 10 cm de profundidad; las herramientas para la toma de muestras fueron esterilizadas antes y después de cada uso. Se retiró de las muestras el material vegetal existente y se guardaron en bolsas herméticas previamente esterilizadas. El sedimento se transportó en neveras con hielo para luego ser congelado y enviado al laboratorio molecular encargado de hacer la extracción del ADN y su respectiva secuenciación.
4. Muestras de suelo: Se definieron puntos de monitoreo con tres muestras compuestas, tomadas cada una entre cuadrantes dentro del área estipulada como unidad muestreal (1 ha aprox.). Se realizaron cuadrantes de alrededor de 30m x 30m sin sobreponerse entre ellos. En cada cuadrante, se generó una cuadrícula de tres puntos equidistantes, a lo largo y ancho, iniciando y terminando en los vértices (9 puntos separados cada 15 metros). Usando guantes, tapabocas y una pala previamente esterilizada, se obtuvo una sub-muestra de suelo de cada uno de los puntos y depositó en una bolsa plástica hermética la cual se transportó en neveras con hielo para luego ser congelada y enviada al laboratorio molecular encargado de hacer la extracción del ADN y su respectiva secuenciación.
5. Una vez colectadas las muestras se procedió al procesamiento y análisis de las mismas en dos etapas específicas: Extracción de ADN: Las muestras de agua y suelo provenientes de 4 matrices (agua superficial, agua subterránea, sedimento y suelo), fueron conservadas a -20 °C hasta el momento de extracción del ADN. Se usaron los kits NucleoSpin eDNA Water (Machery-Nagel) y NucleoSpin eDNA Soil (Machery-Nagel) para extraer ADN de muestras de agua y suelos, respectivamente, siguiendo las instrucciones del fabricante con algunas modificaciones, que se detallan a continuación. Para la extracción de ADN de muestras de suelo, se partió de 500 mg de material. Se mezclaron los buffers SL1 y SL2 en proporción 1:1 para un volumen de 700 uL con 50 uL de Enhancer SX. Finalmente, el ADN purificado se resuspendió en 30 μL de buffer de elución, en lugar de 100 μL. Para la extracción de ADN de muestras de agua, se cortaron los filtros en pequeños pedazos usando bisturís estériles para facilitar la liberación de material biológico. Los filtros cortados se dejaron en agitación moderada por 10 minutos en 2 mL de buffer DISSOLVE con 25 μL de proteinasa K a 10 mg/mL. A continuación, el ADN suspendido en el buffer DISSOLVE se transfirió a la columna de purificación como especifica el manual, centrifugando a 4500 rpm por 3 minutos, para recuperar la mayor cantidad de ADN posible. En ambos casos, el ADN purificado se mantuvo en refrigeración a 4 °C hasta su amplificación por PCR.
6. Amplificación y secuenciación: Para el dominio Bacteria se secuenció la región V3 - V4 del gen 16S del RNA ribosomal con los primers descritos en Kozich et al (2013), usando una reacción de PCR por muestra. Para todas las reacciones de PCR se usó una mezcla de enzimas HOT FIREPol Blend Master Mix (Solis Biodyne) en volúmenes de 25 μL, con 1 μL de cada primer a 10 μM por reacción. Se usó 2 μL de ADN para la amplificación. El siguiente protocolo de PCR fue empleado para amplificar el gen 16S del RNA ribosomal: 95 °C x 10 min (x1), 95 °C x 15 s, 55 °C x 30 s, 72 °C x 30 s (x35), 72 °C x 5 min (x1). Para asegurar la correcta amplificación de los genes de interés, productos de PCR seleccionados aleatoriamente fueron visualizados por electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% hecho con buffer TAE 1X y teñido con SYBRSafe (Invitrogen). Los productos de PCR del 16S fueron mezclados en grupos separados. Se purificaron 100 μL de estos grupos usando las perlas magnéticas AMPure XP (Beckman-Coultier), con una relación volumétrica de 0.7X en relación con los productos de PCR. Los productos de PCR purificados se eluyeron en agua tipo 1 esteril y fueron diluidos por un factor de 5. Estos productos purificados y diluidos fueron cuantificados con el instrumento QBit 2.0 usando el kit dsDNA High Sensitivity (Invitrogen). La integridad del ADN y el tamaño promedio de los fragmentos fueron revisados con el instrumento Qsep 100 (Bioptic) con el kit de reactivos S2. Para hongos, se secuenció una reacción de PCR por muestra, a partir de la amplificación de la región cubierta por los primers universales IT5-F e ITS1-R con parte de los adaptadores de secuenciación en los extremos 5’ del primer. Los productos de PCR de estos primers fueron usados como templado para una segunda PCR, donde se anillan el resto de los adaptadores con las secuencias index. Para todas las reacciones de PCR se usó una mezcla de enzimas HOT FIREPol Blend Master Mix (Solis Biodyne) en volúmenes de 25 μL, con 1 μL de cada primer a 10 μM por reacción. Se usaron 3 μL de ADN para la amplificación. El siguiente protocolo de PCR fue empleado para amplificar la primera reacción: 95 °C x 10 min (x1), 95 °C x 15 s, 55 °C x 45 s, 72 °C x 30 s (x35), 72 °C x 5 min (x1). Para la segunda reacción de PCR de ITS se usó el siguiente protocolo: 95 °C x 10 min (x1), 95 °C x 30 s, 56 °C x 60 s, 72 °C x 30 s (x10), 72 °C x 5 min (x1). Para asegurar la correcta amplificación de los genes de interés, productos de la primera reacción de PCR seleccionados aleatoriamente fueron visualizados por electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% hecho con buffer TAE 1X y teñido con SYBRSafe (Invitrogen). El correcto anillaje de los adaptadores en la segunda PCR fue confirmado en un gel con las mismas características, exceptuando una concentración de agarosa de 3%, lo que permite ver el aumento de tamaño de los productos de PCR antes y después de la unión de los adaptadores. Finalmente, para Eucaria, se secuenció una reacción de PCR por muestra, a partir de la amplificación de la región 18S-V9-F, tomados de Choi & Park (2020), con parte de los adaptadores de secuenciación en los extremos 5’ del primer. Los productos de PCR de estos primers fueron usados como templado para una segunda PCR, donde se anillan el resto de los adaptadores con las secuencias index. Para todas las reacciones de PCR se usó una mezcla de enzimas HOT FIREPol Blend Master Mix (Solis Biodyne) en volúmenes de 25 μL, con 1 μL de cada primer a 10 μM por reacción. Se usaron 2 μL de ADN para la amplificación. El siguiente protocolo de PCR fue empleado para amplificar la primera reacción: 95 °C x 10 min (x1), 95 °C x 15 s, 55 °C x 30 s, 72 °C x 30 s (x35), 72 °C x 5 min (x1). Para la segunda reacción de PCR se usó el siguiente protocolo: 95 °C x 10 min (x1), 95 °C x 30 s, 56 °C x 60 s, 72 °C x 30 s (x10), 72 °C x 5 min (x1). Para asegurar la correcta amplificación de los genes de interés, productos de la primera reacción de PCR seleccionados aleatoriamente fueron visualizados por electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% hecho con buffer TAE 1X y teñido con SYBRSafe (Invitrogen). El correcto anillaje de los adaptadores en la segunda PCR fue confirmado en un gel con las mismas características, exceptuando una concentración de agarosa de 3%, lo que permite ver el aumento de tamaño de los productos de PCR antes y después de la unión de los adaptadores. Los productos de la segunda reacción de PCR para hongos y eucaria fueron mezclados en grupos separados. Se purificaron 100 μL de estos grupos usando las perlas magnéticas AMPure XP (Beckman-Coultier), con una relación volumétrica de 0.7X en relación con los productos de PCR. Los productos de PCR purificados se eluyeron en agua tipo 1 esteril y fueron diluidos por un factor de 5. Estos productos purificados y diluidos fueron cuantificados con el instrumento QBit 2.0 usando el kit dsDNA High Sensitivity (Invitrogen). La integridad del ADN y el tamaño promedio de los fragmentos fueron revisados con el instrumento Qsep 100 (Bioptic) con el kit de reactivos S2. Las librerías obtenidas para cada grupo fueron normalizadas a 4nM, antes de ser denaturadas y diluidas siguiendo el protocolo estándar para secuenciación en un equipo MiSeq (Illumina). Las secuencias generadas por tecnología de última generación (Illumina) fueron ensambladas y separadas por sitio de muestreo usando diferentes programas bioinformáticos. Las secuencias finales de metabarcoding se analizaron usando la plataforma QIIME2 para cada grupo biológico independientemente, generando ASVs para bacteria y OTUs para los grupos restantes. Se utilizaron diferentes clasificadores para realizar la asignación taxonómica de lo obtenido para cada grupo. Se utilizó el método core-metrics-phylogenetic del plugin Diversity para generar las métricas de beta diversidad para cada dominio. Adicionalmente, mediante los métodos alpha-group-significance y beta-group-significance, se analizó si los valores de alfa y beta diversidad podían agrupar a los datos por categorías de interés. El primer método se ejecutó con los índices de Shannon y Faith PD, y el segundo con Bray-Curtis, weighted UniFrac (Lozupone y Knight. 2005) y unweighted UniFrac (Lozupone et al. 2007). Con el fin de evidenciar diferencias significativas entre muestras, para análisis de diversidad alpha se realizó la prueba no-paramétrica Kruskal-Wallis, y para diversidad beta la prueba no-paramétrica PERMANOVA.

Este recurso contiene un total de 156.015 registros biológicos, pertenecientes a los reinos Bacteria (89.402), Fungi (20.812), Protozoa (20.751), Animalia (14.399), Chromista (8.565), Archaea (1267) y Plantae (819). Con un 33% clasificado a nivel de género, 19% a familia, 14% a filo, 11% a orden, 11% a clase, 9% a especie y 36% a otras categorías.

1. Bacteria
   rank: kingdom
2. Chromista
   rank: kingdom
3. Fungi
   rank: kingdom
4. Animalia
   rank: kingdom
5. Plantae
   rank: kingdom
6. Protozoa
   rank: kingdom
7. Archaea
   rank: kingdom

El presente estudio fue llevado a cabo en el occidente del departamento de Santander, en la provincia de Yariguíes, situada en el valle medio del río Magdalena, en los corregimientos El Centro, El Pedral, Kilometro 8, Puente Sogamoso, y las veredas Bocas de Sogamoso del municipio de Puerto Wilches.