Hongos endófitos asociados a ecosistemas de boques tropicales en Cali

Study Extent

Los datos fuero recolectados en el Predio La Carolina, vereda El Carmen, corregimiento de Villacarmelo, Santiago de Cali.

Sampling

Se realizo una primera colecta de material vegetal (arbol Otoba gracilipes) en el predio de bosque montano bajo llamado " La Carolina" 3”24”10.662” N76ª36’52.774” W. En la segunda colecta se recogieron hojas y tallos (arbol Lacre Vismia baccifera) 3°23'5.2” N 76°37’23.7” W. Todas las muestras fueron retiradas cuidadosamente de los diferentes ejemplares de los arboles con ayuda de navja y/o desjarreteadora y se guardaron en bolsas de plasctico esteril de cierre hermetico.

Method steps

1. Colecta de tejidos vegetales: Se realizo una primera colecta de material vegetal (arbol Otoba gracilipes) en el predio de bosque montano bajo llamado " La Carolina" 3”24”10.662” N76ª36’52.774” W. En la segunda colecta se recogieron hojas y tallos (arbol Lacre Vismia baccifera) 3°23'5.2” N 76°37’23.7” W. Todas las muestras fueron retiradas cuidadosamente de los diferentes ejemplares de los arboles con ayuda de navaja y/o desjarreteadora y se guardaron en bolsas de plasctico esteril de cierre hermético.
2. Aislamiento de cepas de hongos endófitos: En una cabina de flujo laminar se cortaron cuadrados de 0,5 cm material vegetal, tanto hojas como de corteza. De las hojas se cortaron 3 trozos al azar y se clasificaron como a, b y c. Dichos trozos se lavaron con solución tween 80 al 0.01% empleando vortex, para así pasarlas a un Falcon con etanol al 70% durante 1 minuto., después de esto se pasaron a un Falcon con hipoclorito de sodio al 3% por 15 minutos. Se lavaron nuevamente con tween 0 al 0.01% y se enjuagaron con agua estéril para así ser sembradas en cajas Petri que contenían medio PDA a pH 4,5 suplementado con clindamicina (0,2 mL /100 mL ). Los medios de cultivo se incubaron a 28°C durante 7 días.
3. Extracción de ADN, identificación molecular: Los hongos se identificaron por secuenciación de DNAr basada en el espaciador transcrito interno (ITS). El DNA genómico de los endófitos se extrajo de la biomasa cultivada in vitro en placas Petri con PDA, haciendo uso del kit DNA de tejido EZNA® (Omega BioTek) con algunas modificaciones. Este se cuantificó con el espectrofotómetro NanoDropTM 2000 (ThermoFisher SCIENTIFIC) donde se emplearon cebadores fúngicos universales para amplificar la región del DNAr (ITS) (forward 5'-AGAGTTTGATCHYTYAGATGG-3' y reverse 5'-TTGTTAACCACGGYTCGACTT-3'). Los parámetros para la PCR fueron a 94°C durante un minuto y 35 ciclos de 94°C por 30 segundos, el cebador específico TM 60°C durante 30 segundos y 72°C durante cinco minutos, empleando la DNA polimerasa Taq (Thermos Fisher SCIENTIFIC) en un termociclador Swift ™ MiniPro (ESCO). Los productos de PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 1% y se purificaron haciendo uso de Wizard SV Gel y PCR Clean-Up System (Promega, EE. UU.). Las muestras se llevaron a un sistema de secuenciación automatizado ABI prism 3500 (Applied Biosystems); los fragmentos obtenidos se editaron en el software MEGA-X. A continuación, estas fueron contrastadas con secuencias disponibles en el GenBank mediante la búsqueda BLAST.
4. Para el primer objetivo espeficico se desarrollo y valido una metodologia tanto para la extraccion de las fracciones ricas en exopolisacaridos (EPS), como para la evaluacion de la actividad antioxidante.

Este recurso contiene 26 registros de hongos endófitos, asociados a los filos Ascomycota (24) y Basidomicetos (2), abarcando ..

1. Nectriaceae
   rank: genus

Los datos fueron tomados en el municipio de Cali, Valle del Cauca.