Bacterias y Arqueas de la transición Andino-Amazónica del departamento del Caquetá - Proyecto Colombia BIO

Study Extent

El estudio se realizó en el camino Andaqui, en el municipio de Belén de los Andaquies, departamento del Caquetá. Por la trocha del camino Andaqui se hizo un recorrido desde la divisoria de aguas límite de los departamentos del Huila y Caquetá, hasta la vereda de las verdes, hasta los puentes de la quebrada de las verdes y el río pescado. En total se realizaron 11 puntos cada 125 metros sobre el nivel del mar, desde 1875 hasta los 500 msnm los cuales fueron numerados con respecto a su altura, donde la altura máxima de 1875 msnm era la 1, y la altura mínima de 500 msnm fue 11. Los puntos se realizaban en las zonas que estaban a la altura exacta y contaban con una cobertura natural, lo menos intervenida posible, por lo que en algunos puntos no fue posible realizar el punto y se realizaron en otros lugares por encontrarse pastos de ganadería.

Sampling

"En cada uno de los cinco puntos de muestreo, se colectaron alrededor de cinco (5) sub-muestras del suelo superficial (0-20cm), retirando la capa de hojarasca superficial si estuviera presente. Las sub-muestras se colectan en la misma bolsa plástica, y son homogenizadas para obtener una muestra compuesta de aproximadamente 200 gramos de suelo. En total se colectaron 54 muestras de suelo para la determinación de bacterias en laboratorio por técnicas moleculares. Para la determinación taxonómica de microorganismos del suelo (Bacterias y Arqueas) en el laboratorio, se siguió la metodología estandarizada en el laboratorio de biotecnología y recursos genéticos del Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas –Sinchi. La extracción de ADN de agua, sedimentos y suelos se realizó usando los kits: powerwater DNA isolation Kit (MoBioLaboratories Carlsbad, CA), powersoil DNA isolation (MoBioLaboratories Carlsbad, CA) y núcleo spin soil –DNA, RNA and proteinpurification (macherey-nagel Alemania), respectivamente. Siguiendo las instrucciones del fabricante. Se amplificó la región V3-V4 del gen 16S ARNr con los iniciadores S-D-Bact-0341-b-S-17, 5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3 y S-D-Bact-0785-a-A-21, 5-GACTACHVGGGTATCTATCC-3 descritos por Herlemann et al. (2011). Las muestras fueron enviadas a Macrogen (Corea) para ser secuenciadas en una corrida de paired-endMiSeq2 X 300. El análisis de las secuencias se realizó con el programa QIIME scripts versión 1.8.0-20140103 (Caporaso et al. 2010). La asignación taxonómica se realizó con la base de datos de Greengenes. La abundancia relativa de los diferentes grupos microbianos se estimó en cada comunidad comparando el número de secuencias clasificadas que pertenecen a un grupo bacteriano específico versus el número de secuencias clasificadas por muestra."

Quality Control

En campo las bolsas se marcaron con el número de cada punto, con las siglas del nombre del municipio de muestreo Belén de los Andaquies (BA), un número continuo para las alturas de los puntos de muestreos donde la altura máxima de 1875 msnm, así: BA1875. En laboratorio se mantuvo el mismo código para identificar cada una de las muestras durante el aislamiento de las esporas de los hongos, la cual es la estructura morfológica para su determinación taxonómica. El mismo código fue usado para la muestra de suelo para determinar hongos formadores de micorrizas arbusculares por métodos moleculares. Ajuste de vocabularios controlados en el elementos de registro: type y basisOfRecord de acuerdo a la naturaleza de los datos.

Method steps

1. Para la generación de las librerías, primero se llevó a cabo la extracción de ADN a partir de las muestras de suelo. El ADN fue extraído utilizando el kit NucleoSpin®Soil (Macherey-Nagel) siguiendo las especificaciones del fabricante. El ADN obtenido fue verificado en un gel de agarosa 1X y cuantificado por Nanodrop y Quibit.
2. Los ADNs metagenómicos extraídos de las muestras de suelo fueron secuenciadas en una corrida de paired-endMiSeq2X300 (Macrogen). La región amplificada con los iniciadores S-D-Bact-0341-b-S-17, 5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3 y S-D-Bact-0785-a-A-21, 5-GACTACHVGGGTATCTATCC-3 descritos por Herlemann et al., (2011), corresponde a la región V3-V4 del 16S ARNr.
3. El análisis de las secuencias obtenidas se realizó con los programas bioinformaticos FLASH, QIIME (Caporaso et al. 2010) y SWARM (2.0 algorithm) (Mahé et al. 2014). Los datos Paired end fueron concatenados en un único archivo usando FLASH 1.2.11(Fast Length Adjustment of SHortreads)(http://bioinformatics.oxfordjournals.org/content/27/21/2957.full). Una vez ensambladas, las secuencias fueron sometidas a un control de calidad usando los "phred quality scores" contenidos en los archivos.fastq. Para tal propósito se utilizó el comando fastq_quality_filter -q 25 -p 80 -i all.fastq -o all.filtered.fastq -Q33, de la suite FAstXtoolkit. Se retuvieron para los posteriores análisis las secuencias ensambladas cuyos phred scores estuvieron por encima de 25.
4. Con base en las secuencias de alta calidad, se procedió a agrupar las secuencias en unidades taxonómicas operacionales (OTUs) utilizando el algoritmo de clustering SWARM. Con este fin, se hicieron diversas manipulaciones en el formato de las secuencias, para ajustarlas a los requerimientos del SWARM. El proceso de clustering consiste en la comparación pareada de las de las secuencias que pasaron el control de calidad, para agruparlas de acuerdo con su similaridad. Este procedimiento generó secuencias únicas, que posteriormente fueron agrupadas en OTUs.
5. Con el fin de eliminar las secuencias quiméricas se utilizó la aplicación UCHIME y se generaron dos tablas de OTUs en las que solo se retuvieron los OTUs que se encuentran en más de 5 y 10 muestras. Con estos procedimientos se eliminan las secuencias que se encuentran poco representadas en el set de datos para que los análisis posteriores sean más confiables. Finalmente, a cada uno de los OTUs, se les hizo una asignación taxonómica utilizando el alineador del Ribosomal Database Project (Wang et al. 2007) y la base de datos SILVA 111 (Quast et al. 2012) como referencia de alineamiento. Este proceso generó un archivo con la asignación taxonómica de seis niveles de resolución (Kindom, Phylum, Clase, Orden, Familia, genero, especie).
6. La abundancia relativa de los diferentes grupos microbianos fue estimada en cada comunidad comparando el número de secuencias clasificadas que pertenecen a un grupo bacteriano específico versus el número de secuencias clasificadas por muestra.
7. Para simplificar el análisis de los datos, las alturas fueron agrupadas en 3 categorías: alta (2000 -1325 msnm), media (1250 – 875 msnm), y baja (750 - 500 msnm).

Para el total de registros colectados se presentan 772 Arqueas y 66160 Bacterias. Los 772 registros de Arqueas corresponden a 1 Reino, 3 Filos, 9 Clases, 8 Órdenes, 11 Familias, 17 Género y 4 Especies únicas. Los 66160 registros de Bacterias corresponden a 1 Reino, 29 Filos, 69 Clases, 130 Órdenes, 254 Familias, 592 Género y 463 Especies únicas

1. Acidobacteria
   rank: phylum
2. Actinobacteria
   rank: phylum
3. Aquificae
   rank: phylum
4. Armatimonadetes
   rank: phylum
5. Bacteroidetes
   rank: phylum
6. Caldiserica
   rank: phylum
7. Caldithrix
   rank: phylum
8. Chlamydiae
   rank: phylum
9. Chlorobi
   rank: phylum
10. Chloroflexi
    rank: phylum
11. Cyanobacteria
    rank: phylum
12. Deferribacteres
    rank: phylum
13. Deinococcus-thermus
    rank: phylum
14. Elusimicrobia
    rank: phylum
15. Fibrobacteres
    rank: phylum
16. Firmicutes
    rank: phylum
17. Fusobacteria
    rank: phylum
18. Gemmatimodetes
    rank: phylum
19. Lentisphaerae
    rank: phylum
20. Nitrospirae
    rank: phylum
21. Planctomycetes
    rank: phylum
22. Poribacteria
    rank: phylum
23. Proteobacteria
    rank: phylum
24. Spirochaetes
    rank: phylum
25. Synergistetes
    rank: phylum
26. Tenericutes
    rank: phylum
27. Thermi
    rank: phylum
28. Thermotogae
    rank: phylum
29. Verrucomicrobia
    rank: phylum
30. Crenarchaeota
    rank: phylum
31. Euryarchaeota
    rank: phylum
32. Parvarchaeota
    rank: phylum

La transición Andino-Amazónica, iniciando en el departamento de Huila, municipio de Acevedo y descendiendo a lo largo del camino Andaki hasta el municipio de Belén de los Andaquíes en el departamento de Caquetá. Abarca desde el bosque de niebla hasta el piedemonte amazónico.