Microorganismos aislados de suelo y material vegetal en el departamento del Magdalena

Study Extent

El proyecto se llevó a cabo en 11 municipios del departamento de Magdalena: Ariguaní, Ciénaga, El Piñón, Guamal, Pivijay, Plato, San Sebastián de Buenavista, Santa Ana, Santa Marta, Sitio nuevo y Zona Bananera. Estos municipios se seleccionaron teniendo en cuenta que representan las condiciones edafoclimáticas de cada subregión y por su vocación hortofrutícola.

Sampling

Se realizó 2 tipos de muestreo para la obtención de datos. 1. Establecimiento de parcelas con sus respectivas matrices donde se llevó a cabo la recolección de muestras de suelo para reconocimiento de microbiota asociada y nemátodos. 2. Toma de muestras de material vegetal con plantas aledañas a la parcela experimental, con el objetivo de reconocer los posibles patógenos que son de interés para los cultivos comerciales y Seguimiento fitosanitario mediante 10 muestreos para definir la biodiversidad microbiológica de las parcelas con el fin de hacer seguimiento a las enfermedades presentes en los cultivos en cada una de las 33 parcelas establecidas en este proyecto.

Quality Control

Para garantizar la calidad de los datos se estandarizo los procedimientos a realizar mediante protocolos para la toma de muestras en campo, manipulación de estas en laboratorio y asilamiento e obtención de microorganismos.

Method steps

1. Generalidades Se establecieron 33 parcelas de 2500 m2 con sus respectivas matrices de las mismas dimensiones, y se procedia con la toma de muestras de interés, dispuestas de la siguiente forma: 1. Toma de muestras de suelo: Cada parcela estaba conformada por 4 subparcelas (Kudzu, Frijol, Crotalaria y Maíz), en cada una de estas se procedió de la siguiente forma: - Se delimitaba el área de la subparcela visualmente y se seleccionaban 5 puntos al azar equidistantes dentro de esa subparcela, allí se tomaba una submuestra de suelo en un cuadrado de 20x20 cm y a una profundidad de 20-30 cm. - Las 5 submuestras tomadas de una subparcela se disponían en la misma bolsa ziploc (Muestra de suelo compuesta), y se repetía este proceso otras 3 veces hasta completar 4 bolsas de muestras que correspondían cada una a una subparcela de las anteriormente mencionadas.
2. Todas las muestras se trasladaron en bolsa Ziploc selladas, rotuladas y conservadas en neveras de icopor desde las parcelas hasta el laboratorio de Fitopatología de la universidad del Magdalena para su procesamiento. el manejo del suelo consistió en tamizarlo por una malla de 2 mm obteniendo de cada subparcela 500gr de suelo, el cual se embolso rotulo y se llevó a conservar en refrigeración.
3. 1.1 Obtención de microrganismos del suelo: Para el aislamiento de bacterias y hongos provenientes del suelo, se procedió a realizar la siguiente metodología. - Se tomo un (1) gramo de suelo y diluyo en 10 ml de agua destilada estéril con el fin de activar la flora microbiana - De esa solución se tomó 1 ml y se depositó en un tubo falcon, aforando hasta completar 10 ml, y así hasta completar una solución de 10^-2 para siembra en PDA y 10^-3 para siembra en AN. - Posteriormente se dispuso 50 microlitros de la solución en cada caja Petri, el cual fue esparcido por todo el agar con su respectivo medio de cultivo. - Después de la siembra, se verificó el crecimiento de microorganismos y se procedió a purificar e incubar a 37°C para bacterias por 24 horas y para hongos a temperatura ambiente por 2-3 días para su identificación. - Con los microorganismos puros se realizaban procesos de descripción morfológica visual y tinción con lactofenol azul diluido (Hongos) y tinción de Gramm (Bacterias). - Teniendo las placas ya preparadas se realizaba el montaje en microscopio en 4X, 10X, 40X y 100X, siendo este el total de observaciones para reconocimiento de estructuras en bacterias, y para hongos solo se llegaba hasta 40X.
4. 1.2 Obtención de Nematodos aislados del suelo: - Se tomó 380-400gr de suelo el cual se diluyo en 1 litro de agua destilada durante dos minutos - Se dejó reposar 1 minuto y se filtró en tres tamices con malla de diferentes tamaños (1.18 mm, 150 micras y 75 micras) - Luego se recogió en un beaker lo obtenido en los tamices de 150 micras y 75 micras y se afora con agua destilada a 200 ml, con el fin de obtener la relación de 400gr de suelo en 200 ml de agua para conteo de nematodos.
5. - Posteriormente las muestras fueron envasadas en tubos Falcón la dilución obtenida (10 ml / tubo), para su centrifugado.
   - Se llevó a centrifuga por 2 minutos a 3000 RPM, y se eliminó el agua obtenida después del centrifugado - Se le adicionó sacarosa al 5% al mismo volumen que se tenía de agua destilada, y posteriormente, se llevó a centrifuga. - Inmediatamente salía de la centrifuga, se echaba el agua de la sacarosa en un beaker y el contenido fue pasado en los tamices de 150 micras y 75 micras y se realizaba nuevamente un lavado con agua destilada, puesto que la sacarosa puede causar plasmólisis en los nematodos. - Se tomaba lo obtenido en los tamices de 150 micras y 75 micras con agua destilada en un beaker y se procedía a observar en caja Petri en el estereoscopio. - Se realizan tres repeticiones y se lleva un conteo de número de nematodos obtenidos en cada tubo (10 ml) para luego estimar el contenido de nematodos que debían quedar en 200 ml de agua a partir de los 400 gr de suelo. - Para la realización de este proceso se lleva al estereoscopio un plato Petri anteriormente cuadriculado en la cara externa con un rotulador permanente y depositando en su interior 10 ml de la solución, donde se procedía a buscar los nematodos en orden ascendente en cada uno de los recuadros de la caja. - Al encontrar un nematodo se procede a hacer la captura, la cual se realiza con ayuda de un micro pipeteador y una micropipeta de 40µl - Al estar capturado en la micropipeta se lleva a un portaobjetos, se adiciona un cubreobjetos y se procede a observar en el microscopio a 4X, 10X y 40X, con el fin de realizar la identificación.
6. Los especímenes se identificaron hasta la menor categoría posible con ayuda de las claves taxonómicas especializadas disponibles. La validez de los nombres científicos se revisó en el GBIF.
7. 2. Toma de muestras de material vegetal: Teniendo en cuenta que este apartado se dividió en varias fases, se realizó de forma específica y en el orden establecido a continuación: 2.1 Toma de muestras para reconocimiento de microorganismos de material vegetal aledaño: Con el objetivo de reconocer los microorganismos presentes en las plantas colindantes a la parcela experimental e identificar aquellos que pueden generar un riesgo para los ciclos de cultivos comerciales, se realizó una toma de muestras de material vegetal a cada una de las 33 parcelas experimentales bajo la siguiente metodología: - En un área de 10 metros alrededor de la parcela experimental, se realizó un recorrido bordeando toda el área mencionada - Se tomaron muestras de las plantas con síntomas y sin síntomas asociados a enfermedades. - Cada una de las plantas tomadas eran depositadas individualmente en bolsas plásticas y rotuladas con los datos de la parcela, día de la toma de muestra y el nombre con el que allí lo conocían. - Las muestras eran depositadas en neveras de icopor y una vez finalizadas las rutas de las zonas, eran llevadas al laboratorio de fitopatología de la universidad del Magdalena.
8. 2.2 Seguimiento fitosanitario a abonos verdes y ciclos de cultivos comerciales para los abonos verdes se procedió de la siguiente manera: - Se realizó una evaluación fitosanitaria planta a planta a cada una de las subparcelas establecidas con excepción de Kudzú. - Se tomaba una muestra vegetal en caso de observar algún síntoma sospechoso de enfermedades. - La muestra era rotulada y conservada hasta llegar al laboratorio de fitopatología de la universidad del magdalena. - Para el abono verde Crotalaria, con fines de investigación profunda, se tomaron muestras con y sin síntomas asociados a enfermedades. Ahora, para el seguimiento fitosanitario a los ciclos de cultivos productivos establecidos en las parcelas, se realizó de la misma forma que con los abonos verdes, un recorrido a todas las plantas, tomando muestras de aquellos que se observara sintomatología asociada a enfermedades, dándose el mismo manejo de la muestra hasta ser entregada en el laboratorio de fitopatología.
9. Manejo de muestras vegetales y extracción de microorganismos epífitos y endófitos: Todas las muestras recibidas eran diligenciadas en una base de datos de ingreso y organizadas por orden de prioridad de aislamiento, a su vez, eran conservadas en una nevera a temperatura de -20°C. Para el aislamiento de sintomáticas como asintomáticas se realizó el siguiente protocolo: - Se elaboraban los medios de cultivos a ser utilizados para el aislamiento de bacterias (AN) y hongos (PDA). - Con los medios listos, se cortaban pequeñas secciones de la muestra (5mm x 5mm) (4 trozos para epifitos y un trozo grande para endófitos), ya fuese sana o con síntomas (verificando que en la sección quedara material sano y enfermo para aquellas sintomáticas) y se desinfectaban bajo los siguientes pasos con el fin de aislar microorganismos de tipo epífito y endófitos: _Lavado con agua destilada estéril (1 minuto) _Lavado con hipoclorito de sodio al 2% (1 minuto) _Lavado con agua destilada estéril (1 minuto) _Lavado con etanol al 70% (1 minuto) _Lavado con agua destilada estéril (1 minuto)
10. Teniendo en cuenta el protocolo mencionado de lavados, se realizaba hasta el tercer lavado para obtención de microorganismos epífitos, teniendo en cuenta que las 4 secciones cortadas debian secarse un poco y posteriormente ubicados equidistantes en cada uno de los medios destinados (2 de AN Y 2 de PDA para cada una de las especies vegetales), pasaban a ser rotulados e incubados hasta observar alfun crecimiento bacteriano o fungico a partir del trozo de la plantas sembrado. Para el caso de microorganismos endófitos, se realizaban los 5 pasos de desinfección, se dejaban secar un poco en papel absorbente estéril y en un mortero tambien esteril, se maceraba hasta obtener una pasta o polvo sin necesidad de agregar agua alguna; el material ya macerado se ubicaba en 4 puntos equidistantes en la misma cantidad de medios que para endófitos, y el proceso de incubación es el mismo.
11. Con los microorganismos ya obtenidos de la siembra inicial de material vegetal, estos eran marcados uno a uno, y se disponian en cultivos individuales, hasta obtener un cultivo puro de cada uno de las colonias obtenidas. Con las bacterias y hongos aislados se realiza el mismo proceso de tinción y montaje al microscopio que se realizó en los microorganismos aislados del suelo. Todos estos microorganismos obtenidos fueron agrupados en morfotipos y seleccionados algunos para su análsis genético para su debida identificacipon por medio de kits y regiones ITS. Todos los microorganismos de la base de datos fueron verificados en GBIF.

El conjunto de datos cuanta con un total de 3.238 registros entre bacterias hongos y nematodos, de los cuales 2.569 datos corresponden a bacterias, así el 4.8% fue identificado hasta el nivel de especie, el 0.7% hasta genero y el 94.5% hasta el nivel taxonómico de reino.

1. Bacteria
   common name: Bacteria rank: kingdom
2. Bacilli
   rank: class
3. Bacillus sp
   rank: genus
4. Pseudomonas sp
   rank: genus
5. Arthrobacter koreensis
   rank: species
6. Bacillus aerius
   rank: species
7. Bacillus albus
   rank: species
8. Bacillus altitudinis
   rank: species
9. Bacillus amyloliquefaciens
   rank: species
10. Bacillus cereus
    rank: species
11. Bacillus inaquosorum
    rank: species
12. Bacillus paramycoides
    rank: species
13. Bacillus safensis
    rank: species
14. Bacillus siamensis
    rank: species
15. Bacillus velezensis
    rank: species
16. Brevibacillus brevis
    rank: species
17. Lysinibacillus fusiformis
    rank: species
18. Lysinibacillus macroides
    rank: species
19. Lysinibacillus xylanilyticus
    rank: species
20. Mammaliicoccus sciuri
    rank: species
21. Microbacterium liquefaciens
    rank: species
22. Microbacterium paraoxydans
    rank: species
23. Microbacterium testaceum
    rank: species
24. Paenibacillus elgii
    rank: species
25. Paenibacillus polymyxa
    rank: species
26. Priestia aryabhattai
    rank: species
27. Pseudomonas libanensis
    rank: species
28. Pseudomonas parafulva
    rank: species
29. Pseudomonas taiwanensis
    rank: species
30. Ralstonia pickettii
    rank: species
31. Serratia marcescens
    rank: species
32. Stenotrophomonas maltophilia
    rank: species
33. Stenotrophomonas pavanii
    rank: species

Para hongos se presentan 592 registros donde el 18.2% fue identifico hasta nivel de especie, el 37.7% de los registros hasta el taxon de genero entre los cuales se encuentra, Agroathelia sp, Alternaria sp, Aspergillus sp, Coprinellus sp, Fusarium sp, Penicillium sp entre otros, el 1% hasta filum, el 0.4% hasta el nivel de orden y clase y por ultimo 42.7 % de los registros fue identificado hasta reino.

1. Fungi
   common name: Hongos rank: kingdom
2. Ascomycota
   rank: phylum
3. Sordariomycetes
   rank: class
4. Sordariales
   rank: order
5. Botryosphaeriales
   rank: order
6. Agroathelia sp
   rank: genus
7. Alternaria sp
   rank: genus
8. Aspergillus sp
   rank: genus
9. Coprinellus sp
   rank: genus
10. Curvularia sp
    rank: genus
11. Fusarium sp
    rank: genus
12. Ovatospora Sp.
    rank: genus
13. Penicillium sp
    rank: genus
14. Preussia sp
    rank: genus
15. Akanthomyces muscarius
    rank: species
16. Alternaria burnsii
    rank: species
17. Aspergillus aculeatinus
    rank: species
18. Aspergillus clavatus
    rank: species
19. Aspergillus nidulans
    rank: species
20. Aspergillus niveus
    rank: species
21. Aspergillus oryzae
    rank: species
22. Aspergillus terreus
    rank: species
23. Bipolaris victoriae
    rank: species
24. Cladosporium oxysporum
    rank: species
25. Colletotrichum aenigma
    rank: species
26. Cladorrhinum samala
    rank: species
27. Curvularia pisi
    rank: species
28. Curvularia pseudobrachyspora
    rank: species
29. Fusarium equiseti
    rank: species
30. Fusarium falciforme
    rank: species
31. Fusarium fujikuroi
    rank: species
32. Fusarium lactis
    rank: species
33. Fusarium oxysporum 
    rank: species
34. Fusarium pseudocircinatum
    rank: species
35. Fusarium pseudonygamai
    rank: species
36. Mucor irregularis
    rank: species
37. Neosetophoma poaceicola
    rank: species
38. Nigrospora osmanthi
    rank: species
39. Paramyrothecium roridum
    rank: species
40. Penicillium oxalicum
    rank: species
41. Penicillium rubens
    rank: species
42. Purpureocillium lilacinum
    rank: species
43. Pseudopestalotiopsis theae
    rank: species
44. Pseudothielavia terricola
    rank: species
45. Trametes versicolor
    rank: species

En el caso de Animalia cuenta con 77 los registros correspondientes al phylum Nematoda, de los cuales el 58% se identifico hasta el nivel de género. Los géneros presentados son: Belonolaimus, Criconemoides, Dolichodorus, Helicotylenchus, Hemicycliophora, Hoplolaimus, Paratylenchus,Scutellonema y Tylenchorhynchus.

1. Belonolaimus
   rank: genus
2. Criconemoides
   rank: genus
3. Dolichodorus
   rank: genus
4. Helicotylenchus
   rank: genus
5. Hemicycliophora
   rank: genus
6. Hoplolaimus
   rank: genus
7. Paratylenchus
   rank: genus
8. Scutellonema
   rank: genus
9. Tylenchorhynchus
   rank: genus

La recolección de muestras se realizaron en parcelas en jurisdicción de los municipios: Plato, Ariguaní, Guamal, Santa Ana, San Sebastián, Pivijay, El Piñón, Sitio nuevo, Santa Marta, Ciénaga y Zona Bananera del departamento del Magdalena.