Monitoreo de microorganismos (metabarcoding) en el área de influencia de la contingencia del pozo Lisama 158

Study Extent

Cuenca de la Quebrada Lizama y Caño Muerto, incluyendo áreas con acciones de recuperación del Programa de Recuperación Ambiental implementadas por Ecopetrol S.A. y áreas cercanas actuando como referencia, todas ubicadas en los municipios de Barrancabermeja y San Vicente de Chucurí, en el departamento de Santander.

Sampling

Se tomaron muestras de agua, sedimento y suelo para caracterizar la diversidad de hongos y bacterias a través de metabarcoding. La recolección de muestras se hizo en nueve puntos para aguas y sedimentos (4 en sitios de referencia y 5 en sitios con implementación de acciones del P.R.A.) y en seis áreas para suelo, que incluyeron tres puntos de muestreo por área (2 referencias y 1 intervenido). El muestreo en agua y sedimento se realizó siguiendo un transecto de alrededor de 100 m por punto de muestreo, en el cual se tomaron tres muestras de 1 litro de agua o alrededor de 250 g de sedimento cada una, cada 50 metros. El muestreo de suelos se hizo a partir de una metodología de cuadrante, donde se obtuvo una muestra compuesta de 16 sub-muestras obtenidas cada metro en una parcela de 4m x 4m. Una vez fueron tomadas las muestras se realizó la extracción de ADN (3 por área de muestreo), la amplificación y secuenciación, y se hizo una limpieza bioinformática de los datos. Estos son descritos en 'Metodología paso a paso'.

Quality Control

En campo: 1) Toma de muestras usando guantes de nitrilo y tapabocas durante todo el proceso; 2) Uso de materiales y equipo nuevos y/o esterilizados entre sub-muestras; 3) Preservación de la muestra en cadena de frío o en seco (para suelos) entre la toma y su procesamiento, y su procesamiento y la extracción de ADN; 4) Preservación en seco de los extractos de ADN hasta la preparación de librerías; y 5) Generación de controles negativos de extracción de ADN. En laboratorio: 1) Generación de tres réplicas de PCR (preparación de librerías) por muestra por grupo biológico; 2) Generación de controles negativos de PCR; 3) Generación de controles positivos con al menos cinco secuencias conocidas para cada grupo biológico; y 4) Inclusión de blancos de secuenciación. En el procesamiento bioinformático: 1) Remoción de secuencias no alineadas; 2) Remoción de secuencias con nucleótidos ambiguos; 3) Remoción de secuencias con una calidad normalizada menor a 3.9; 4) Remoción de secuencias únicas; 5) Eliminación de OTUs con máxima abundancia en muestras control; y 6) Eliminación de PCR más similares a réplicas de otras muestras que a réplicas de su misma muestra.

Method steps

1. Para cada muestra recolectada, se realizó la extracción de ADN dentro de las 24 horas siguientes a la toma de la muestra en un laboratorio instalado en campo, usando el kit comercial Nucleo-Spin Soil con modificaciones de Taberlet et al. (2018). Se amplificó la región V3-V4 del marcador 16S para la caracterización de bacterias, y el marcador ITS1 para la caracterización de hongos. Cada amplificación se realizó por triplicado. La amplificación de ADN, la preparación de librerías y la secuenciación se llevó a cabo en los laboratorios de S.A.S. Argaly en Sainte-Hélène-du-Lac (Francia), usando tecnología NovaSeq de Illumina. Por cada evento de filtración de agua, de extracción, de amplificación y de secuenciación, se incluyó un control negativo. También se incluyó un control positivo usando una comunidad conocida del grupo biológico procesado.
2. La calidad de las secuencias genéticas crudas fueron revisadas en fastQC. Usando los programas OBITools3 y R se realizó la depuración de secuencias. Esta depuración incluyó el ensamblaje de los archivos R1 y R2, la remoción de secuencias con nucleótidos ambiguos, de baja calidad (<0.8), con longitudes menores a 240 o mayores a 280 pb para 16S, y menores a 140 o mayores a 300 pb para ITS, y secuencias con menos de 10 lecturas de soporte. Las secuencias fueron agrupadas en unidades moleculares operacionales (OTU) de acuerdo con una similitud de 97%, usando el algoritmo sumaclust. El programa Qiime2 fue usado para asignar taxonómicamente los OTU generados con la base de datos de referencia SILVA (versión 138) en bacterias, y con una base de datos de referencia personalizada construida a partir todas las secuencias del marcador ITS depositadas en NCBI para el reino Fungi (https://www.ncbi.nlm.nih.gov, Tax ID: 3193) y secuencias generadas por el Instituto Humboldt, para hongos. Las réplicas de PCR por muestra, y de extracción de ADN, fueron adicionadas para obtener la composición más completa posible de cada punto de muestreo. Todas las muestras fueron rareficadas al mínimo número de lecturas por sustrato.
3. Para las muestras recolectadas se manejó un código nomenclatural de identificación, usando un prefijo de acuerdo al evento de muestreo, seguido del código del sustrato, el número del area de muestreo, el número de la extracción de ADN y finalmente el código de la réplica de PCR. Por ejemplo, la muestra T3_A14_1_C es la muestra del tercer evento de monitoreo (T3), de la muestra de agua del área 14 (A14), la extracción de ADN 1 y la réplica de PCR C. Se realizaron cuatro eventos de muestreo (T1, T2, T3, T4), en tres sustratos: suelo (SU), sedimento (SE) y agua (A). Por cada área de muestreo se obtuvieron tres extracciones de ADN, y por cada extracción de ADN, se realizaron tres réplicas de PCR.

3228 registros identificados a nivel de dominio y reino

1. Bacteria
   common name: Bacteria rank: domain
2. Fungi
   common name: Hongos rank: kingdom

El monitoreo se efectuó en el area de influencia del Programa de Recuperación Ambiental - P.R.A., en la cuenca de la Quebrada Lizama y Caño Muerto, municipios de Barrancabermeja y San Vicente de Chucurí (Santander), incluyendo zonas de implementación de acciones de recuperación del Programa y áreas de referencia (sin implementación). En suelos, el muestreo incluyó siembras del Programa de Recuperación Ambiental, y como referencia, áreas con cobertura boscosa (principalmente bosque ripario), y areas sin cobertura (pastos limpios).