Registros de Pediococcus acidilactici asociados al proyecto: Bacterias lácticas asociadas a la producción de queso costeño en el Departamento del Atlántico

Study Extent

Departamento del Atlántico, municipio de Candelaria, estudio de tipo transversal, muestreo único.

Sampling

La toma de muestra de queso se realizó en un evento de muestreo, se tomaron 250 gr de muestra que fueron procesadas por métodos de cultivo dependiente de microorganiasmos. Las muestras se transportaron refrigeradas a una temperatura de 4°C ± 2°C hasta su procesamiento en el Laboratorio de Lácteos y Alimentos de la Universidad Libre-Barranquilla.

Quality Control

Control de temperatura en etapa de transporte de muestras. Control y evaluación de fuentes de contaminación en la etapa de procesamiento de las muestras. Control de calidad y pureza de extractos de ADN para fase de identificación molecular.

Method steps

1. Preparación de homogenizados y diluciones: Se pesaron 10 gramos de las muestras y llevados a 90 ml de agua peptonada al 0,1%, a partir de esta se realizaron diluciones seriadas.
2. Siembra: Las diluciones fueron sembradas en profundidad en el medio de cultivo De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) (De Man et al.1960) MRS e incubadas por 72 horas a 30°C en condiciones de anaerobiosis con ayuda del sistema Anaerocult ® (Merck).
3. Recuento microbiano: Se realizó recuento microbiano conforme a las especificaciones de la NTC 5034. Se realizó coloración de Gram, prueba de catalasa y oxidasa a los cultivos obtenidos.
4. Extracción de ADN: 2005). Con el objeto de contar con material genómico apropiado para los estudios moleculares los aislados fueron multiplicados en caldo MRS e incubados a 30°C en anaerobiosis, con ayuda del sistema Anaerocult® (Merck), hasta alcanzar una densidad óptica (OD) de 0.8 a 600 nm. Las células bacterianas fueron concentradas por centrifugación, la extracción de ADN se realizó con ayuda del Kit Dneasy blood and tissue QUIAGEN ® para bacterias gram positivas siguiendo las instrucciones del fabricante. La cuantificación de los ácidos nucleicos extraídos se realizó mediante espectrofotometría de absorbancia a una longitud de onda de 260nm con el equipo NANODROP ®, este equipo tiene adoptado un software y los datos se acoplan a una hoja de Excel, permitiendo el registro automático.
5. Ensayos de Reacción en Cadena de la Polimerasa-PCR: Para la identificación molecular se realizó amplificación de los ácidos nucleícos a través de la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) utilizando los primers universales para la amplificación de la subunidad ribosomal 16S DNA 1492r y 27f. Los amplificados fueron corridos por electroforesis a 110 Voltios por 30 minutos y las bandas obtenidas fueron purificadas con ayuda del kit QIAquick PCR Purification Kit QUIAGEN ® siguiendo las instrucciones del fabricante.
6. Secuenciamiento: Los amplificados obtenidos fueron secuenciados mediante el método de Sanger, las secuencias fueron alineadas utilizando el programa CLUSTAL W y alineadas manualmente utilizando el programa BIOEDIT, estas secuencias fueron comparadas con la base de datos Ribosomal Database Project (RDP) (http://rdpwww.life.uiuc.edu/) con ayuda de la herramienta BLAST-2 NCBI. Finalmente las secuencias fueron utilizadas para la construcción de árboles filogenéticosmediante métodos de máxima verosimilitud (MV).

Las bacterias lácticas fueron identificadas a nivel de especie.

1. Pediococcus acidilactici
   rank: species

Las muestras fueron tomadas en Candelaria, Atlántico.