Registro de un banco de tejidos de cuatro especies marinas para el estudio genético y de desborde en las áreas marinas protegidas del Caribe colombiano

Study Extent

SFF Los Flamencos (La Guajira) RIOHACHA (La Guajira) DIBULLA (La Guajira) PNN Tayrona (Magdalena) TAGANGA-PUNTA BETIN (Magdalena) SANTA MARTA-PUNTA GLORIA (Magdalena) CIÉNAGA-PUEBLO VIEJO (Magdalena) BANCO DE LAS ANIMAS (Magdalena) BOCA DE LA BARRA (Magdalena) SFF Ciénaga Grande de Santa Marta (Magdalena) Vía al Parque Isla de Salamanca (Magdalena) PUERTO COLOMBIA (Atlántico) TIERRABOMBA (Bolívar) CIÉNAGA DE LA VIRGEN (Bolívar) PNN Nuestra Señora del Rosario y San Bernardo (Bolívar) SFF El Corchal (Bolívar) GOLFO DE MORROSQUILLO (Sucre) BAHÍA DE CISPATÁ (Cordoba) ISLA FUERTE (Bolívar) CAPURGANÁ (Chocó) PNN Old Providence MCBean (Archipiélago de San Andrés, Providencia y Santa Catalina) SAN ANDRÉS ISLA (Archipiélago de San Andrés, Providencia y Santa Catalina) CAYO RONCADOR (Archipiélago de San Andrés, Providencia y Santa Catalina)

Sampling

Para los caracoles de Cittarium pica se hicieron recolectas manuales y la mayoría de los ejmeplares fueron liberados después de haberle cortado un pedazo de tejido del pie. Para el caso de los peces, se tuvo apoyo de los pescadores para los muestreos. A los peces se les tomó muestras de tejido muscular y un pedazo de la aleta caudal. Todos los tejidos fueron fijados en alcohol etílico al 96% y mantenidos en congelador a -20°C.

Quality Control

Los tejidos fueron rotulados con fecha, localidad y un código único de identificación.

Method steps

1. Fase de laboratorio La extracción de ADN se realizó a partir de la aleta caudal, mediante la utilización de un protocolo convencional, empleando acetato de amonio como solución precipitadora de proteínas y alcohol isopropílico y etanol (70%) para el aislamiento y purificación del ADN. El ADN extraído se verificó mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa a una concentración de 0.8% y empleando GelRed™ Nucleic Acid Gel Stain para la tinción de cada muestra, con parámetros de corrida de 90 voltios durante 30 minutos. La calidad de la extracción fue revelada en un fotodocumentador BioDoc-It® Imaging System UVP. Las concentraciones de ADN se determinaron por medio de espectrofotometría de luz ultravioleta. Se emplearon como marcadores moleculares loci microsatélites, siguiendo las condiciones de amplificación propuestas por varios autores que describieron los marcadores para cada especie. La amplificación se realizó de manera general en un volumen de 10μL de 10 producto final en una mezcla constituida por 2 μL de Buffer (10 X), 0.4 μL de MgCl2 (50 mM), 0.2 μL de dNTPs (1 mM), 0.04μL de cada primer F (10 mM), 0.16μL de cada primer R (10 mM), 0.4 μL de Taq polimerasa (5 U/μL) y 1.5 μL de ADN. La PCR se realizó utilizando un termociclador ESCOSwiftTM MaxPro con los siguientes perfiles de temperatura: desnaturalización a 95°C por 15 min, seguido por 38 ciclos de desnaturalización a 95°C por 30s, alineamiento a 55°C por 46s y extensión a 72°C por 45s, con una extensión final a 72°C por 30 min. Los productos de amplificación fueron verificados en geles de agarosa al 2% con la ayuda de un marcador de peso molecular de 1000pb para estimar el tamaño del fragmento. La genotipificación de los productos de PCR se realizó mediante electroforesis capilar en el equipo QUIAGEN QIAxcel Advanced, utilizando el cartucho de alta resolución (QIAxcel DNA High Resolution Kit). El tamaño de cada amplificado se determinó con el software QIAxcel ScreenGel versión 1.0, utilizando un marcador de alineamiento entre 15 y 1000 bp que migra con cada una de las muestras. El individuo se consideró heterocigoto cuando la altura máxima del pico menor era superior al 70% de la altura máxima del pico mayor. En el caso contrario, o cuando un sólo pico estuvo presente, se consideró homocigoto (Butler, 2001). Análisis de información Para evaluar el estado genético se calcularon las medidas de variabilidad genética: frecuencias alélicas, el número de alelos por locus (Na), la heterocigosidad observada (Ho) y esperada (He). Adicionalmente se determinó el índice de endogamia (Fis; Robertson y Hill, 1984) para cada población. Todo esto se hizo utilizando el paquete computacional GENETIX v.4.05 (Belkhir, 2003) y los intervalos de confianza se estimaron con 1000 bootstraps. Se determinó la pérdida de variabilidad genética a partir del déficit de heterocigotos evaluando la presencia de alelos nulos y cuellos de botella. Para ello se realizó una prueba de desviación del Equilibrio de Hardy-Weinberg (E-HW) a partir de la prueba de U-Scores de probabilidad de Raymond y Rousset (1995), utilizando el programa GENEPOP v.3.4 (Raymond y Rousset, 1995). La presencia de alelos nulos en cada locus analizado se evaluó con el programa MICRO-CHECKER (Van Oosterhout et al., 2004). También se realizó un análisis de desequilibrio de ligamiento con el propósito de valorar la independencia de los genotipos de un locus con respecto a los otros, esto se hizo para evitar redundancia en la información de los loci microsatelites empleados (GENEPOP v.3.4). La estructura genética de la población de C. pica se evaluó mediante las diferencias y relaciones genéticas. Para ello, primero se realizó un análisis estadístico θ(Fst), el cual permite comparar entre los sitios de muestreo y estimar el grado de diferenciación entre ellos. Adicionalmente, se utilizó un análisis jerárquico de varianza molecular (AMOVA) pare conocer cuáles de los componentes dentro de las comparaciones explica la variación genética (sí la hay). Para esto se utilizó el programa Arlequín 2000 (Schneider et al., 2000). Así mismo, con el propósito de verificar la conformación grupal de cada sitio muestreado y conocer el origen real de los especímenes muestreados, se hizo un análisis de asignación en el programa GENECLASS (Piry et al., 2004). Por último, se utilizaron las frecuencias alélicas para conocer si en todo el set de muestras hay presencia de poblaciones discretas, existencia de zonas hibridas (ó de mezcla) e identificar los individuos migrantes y los ya mezclados. Este procedimiento se realizó en el programa STRUCTURE 2.3.3 (Hubisz et al., 2009) y para ejecutarlo se empleó las recomendaciones de los autores. Para la estimación del patrón de dispersión de los individuos de cada especie entre las diferentes localidades muestreadas, se realizó un análisis de similaridad genética a través de la elaboración de dendrogramas construidos usando el coeficiente o distancia de Nei (1972) y el método de agrupamiento Neighbor-Joining implementado en el programa MEGA 5 (Tamura et al., 2011). Además, se realizó un análisis de asignación de individuos para las cuatro especies en el programa GENECLASS (Piry et al., 2004). Este método proporciona un patrón de asignación/exclusión de individuos a su correcta población de origen, estableciendo parámetros para la clasificación de individuos inmigrantes o residentes. Con esta información se elaboró un modelo gráfico del patrón de conectividad de la población de cada especie muestreada en el Caribe colombiano, en el cual se muestra la intensidad y direccionalidad del flujo génico entre las diferentes localidades.

Este proyecto se enfoco en el pargo rayado Lutjanus synagris, el caracol burgao Cittarium pica, el lebranche Mugil liza y la lisa Mugil incilis

1. Cittarium pica
   rank: species
2. Mugil incilis
   rank: species
3. Lutjanus synagris
   rank: species

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