Diversidad de patógenos responsables de enfermedades en el cultivo de cacao en Colombia

Study Extent

Regiones de Colombia productoras de cacao con mayor incidencia de enfermedades producidas por los patógenos Moniliopthora roreri, Moniliphthora perniciosa, Ceratocystis sp., Rosellinia sp. y Phytophthora sp. Las colectas se concentraron en regiones consideradas como zonas de mayor diversidad de estos patógenos (Tolima, Huila, Santander, Valle del Cauca y Arauca) responsables de los bajos rendimientos del cultivo de cacao en el país.

Sampling

Se tomaron muestras de tejido (frutos, raíces, ramas y suelo) procedentes de Theobroma cacao que presentaban síntomas y signos de las distintas enfermedades producidas por los patógenos de interés. En el caso de Ceratocystis, de cada municipio se seleccionaron dos localidades, dentro de las cuales, se muestrearon cinco fincas productoras de cacao con presencia de la enfermedad mal de machete. Se realizó un muestreo en 1 ha de siembra, identificando árboles con marchitamiento de hojas y troncos con perforaciones que contenían aserrín en los sitios de entrada del insecto Xyleborus ferrugineus (Fabricius, 1801) conocido como el trasmisor de la enfermedad. Una muestra de 50 g de suelo con presencia de aserrín fresco se colectó de estos mismos árboles y se depositó en bolsas de papel debidamente rotuladas, para su posterior traslado al laboratorio.

Quality Control

Caracterización morfológica y molecular a nivel de género y especie

Method steps

1. Las muestras colectadas fueron procesadas en el laboratorio según las distintas metodologías empleadas para el aislamiento de cada patógeno. Se utilizaron medios de cultivo selectivos y enriquecidos junto con las condiciones específicas de crecimiento para cada género fúngico.
2. La Caracterización morfológica se llevo a cabo a nivel macro y microscópico mediante el uso de claves taxonómicas e identificación de estructuras típicas del hongo.
3. Para caracterizar a nivel molecular los aislamientos se estandarizaron las metodologías para la obtención de biomasa y posterior extracción de ADN. La extracción de material genético se realizó empleando distintos protocolos como el protocolo de extracción de ADN CTAB 2% descrito por Griffith y Shaw (1998), el protocolo comercial descrito por ZYMO Research para el Quick -DNA Kit fúngica / bacteriana Microprep y la metodología suministrada por el Laboratorio de Cultivos Perennes Sostenibles de ARS (Agricultural Research Service) USDA (US Department of Agriculture).
4. Posteriormente, por PCR se amplificó la región ITS utilizando cebadores ITS 1 y 4 para Moniliopthora roreri, Moniliphthora perniciosa, Ceratocystis sp, Rosellinia sp. y Phytophthora sp. Para Ceratocystis se emplearon además los genes β-Tubulina (βT-1), región del gen de la subunidad de proteína de unión a nucleótidos de guanina (MS204), segunda subunidad mayor de la RNA polimerasa (RPBII) y 60S proteína ribosomal L37 (FG1093).
5. Los amplificados fueron secuenciados y los resultados fueron comparados con la información disponible en las bases de datos del NCBI para su identificación a nivel de género y en algunos casos a nivel de especie. Los aislamientos de Ceratocystis colectados de las distintas zonas productoras de cacao fueron caracterizados también filogenéticamente utilizando los 4 locis genómicos basados en los métodos de Máxima verosimilitud e Inferencia Bayesiana. Con esta identificación se determinó la especie de los asilamientos de Ceratocystis evaluados.

De los 79 registros encontrados, 43 se determinaron al nivel de especie y 36 a nivel de género. Las especies identificadas fueron: Ceratocystis cacaofunesta, Moniliophthora perniciosa y Moniliophthora roreri. En cuanto a los géneros se encontraron: Ceratocystis, Moniliophthora, Phytophthora y Rosellinia.

1. Ceratocystis cacaofunesta
   common name: Ceratocystis cacaofunesta rank: species
2. Rosellinia sp.
   common name: Rosellinia sp. rank: genus
3. Phytophthora sp.
   common name: Phytophthora sp. rank: genus
4. Moniliophthora roreri
   common name: Moniliophthora roreri rank: species
5. Moniliophthora perniciosa
   common name: Moniliophthora perniciosa rank: species

Las zonas de recolección de especímenes fueron Santander (07° 19.51' 90"N, -73° 7.06' 90"W), Huila (02° 12’ 33.7’’N, -75° 37’ 056’’W),Tolima (05°7'34.3"N, -74°59'49.1"W), Valle del Cauca (3°15′39″ N, 76°32′22″ W) y Arauca (7°5′25″ N, 70°45′42″ W).