Muestra de Cladosporium tenuissimum asociado a la roña en gulupa, en el departamento de Tolima

Study Extent

Se realizo un muestreo para colecta de material vegetal en cultivos comerciales de gulupa en los municipios de Casabianca, Santa Isabel y Rovira (departamento de Tolima). Las muestras vegetales colectadas fueron georreferenciadas, empacadas y rotuladas para su posterior procesamiento e identificación de patógenos en el C.I Nataima.

Sampling

Las muestras de tejido vegetal fueron procesadas en el laboratorio de Fitopatología para la obtención de cultivo puro de los patógenos; Del material enfermo traído de campo fueron escogidas muestras en etapas intermedias de la lesión, para luego realizar un proceso convencional de desinfección: brevemente, en condiciones de asepsia el tejido fue cortado en trozos de 0,25 cm2 lavados con alcohol al 70% por 30 segundos, luego con hipoclorito de sodio al 2% por 45 segundos y enjuagados tres veces con agua destilada. Los trozos se dejaron secar y luego fueron sembrados en medios de cultivo (las lesiones asociadas con roña), los trozos de tejido desinfectado fueron dispuestos en medio PDA. Luego de los 5 días de incubación, los aislamientos con características de Cladosporium sp. se llevaron a cultivo puro e identificación por estructuras vegetativas y reproductivas empleando claves taxonómicas para cada grupo o taxon.

Quality Control

A partir de hojas con síntomas de roña (Cladosporium sp) colectadas en el municipio de Casabianca, con coordenadas geográficas (5°5.9´7.6" LN y 75°3´38.2" LO) y altura de 1608 msnm, se obtuvo un aislamiento del hongo (FR29) empleando un proceso de desinfección convencional, para obtención de cultivo puro y monospórico en medio de cultivo PDA.. El aislamiento obtenido en PDA presentó una colonia de color verde a verde oliva, con una tasa de crecimiento de 2.98 mm·día-1. La relación largo/ancho de conidia terminal, intercalar y ramoconidia fue de 1.44, 1.59 y 2.72 respectivamente. La patogenicidad del aislamiento fue evaluada por aplicación de los postulados de Koch en 10 hojas desprendidas de gulupa mediante inoculación artificial empleando una concentración de 1x106 conidias/ml, hojas inoculadas con agua destilada estéril fueron empleadas como testigo absoluto En la prueba de patogenicidad en hojas se observaron síntomas idénticos a los encontrados en campo, el patógeno fue aislado en medio de cultivo puro y su morfología constada por microscopia óptica. Un análisis combinado de las regiones transcritas espaciadoras internas (ITS) revelaron que el aislamiento pertenecía a un grupo de aislamientos auténticos de C. tenuissimum (porcentaje de identidad del 99% con relación a la accesión MF473304.1 registrada en el genbank). Con base en estos resultados, fue identificado C. tenuissimum como causante de la roña en gulupa en el país. Los restantes 22 aislamientos obtenidos fueron identificados a nivel molecular como C. cladosporioides.

Method steps

1. La caracterización macroscópica de Cladosporium sp fue realizada por: medición del crecimiento de la colonia a partir del día 8 y hasta el día 13 después de la siembra en PDA; Adicionalmente, se determinó el color, aspecto y textura de cada aislamiento.
2. La caracterización microscópica de Cladosporium se realizó por mediciones micrométricas asociados a órganos reproductivos asexuales. Inicialmente cada aislamiento del hongo fue llevado a microcultivo, para luego ser observado en microscopio de luz (Zeizz), en el cual fueron medidas el ancho y largo de conidias terminales (AT y LT), intercalares (AI y LI) y ramoconidias (AR y LR). Las mediciones fueron realizadas en 20 estructuras por cada tipo de conidia por aislamiento.
3. La caracterización molecular de los aislamientos de Cladosporium se realizó a partir de la extracción de AND de cultivo puro monospórico de 15 días para la obtención de biomasa del hongo empleando la metodología de Moslem et al., 2010;, el DNA extraído fue cuantificado con ayuda de un nanodrop one (Thermo Scientific). El ADN extraído de los asilamientos fue amplificado empleando un fragmento de la región ITS con los siguientes primers ITS1 5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ITS2 5’- GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3' (Bensch et al., 2010).
4. Posteriormente, se visualizaron los productos de PCR mediante corrido electroforético en gel de agarosa al 1.5%. Los productos de PCR fueron enviados al Instituto de Genética de la Universidad Nacional de Colombia para el Servicio de Secuenciación y Análisis Molecular – SsiGMoL. Seguidamente, las secuencias se editaron mediante leer con programas como BioEdit Sequence Alignment Editor y la identificación determinando su porcentaje de identidad nucleotídica usando algoritmo heurístico de Blast, teniendo como base de comparación el NCBI (National Center for Biotechnology Information).

La muestra colectada fue identificada como Cladosporium tenuissimum como causante de la roña en gulupa en Colombia.

1. Cladosporium tenuissimum
   rank: species

Las muestras fueron recolectadas en los municipios de Casabianca, Santa Isabel y Rovira (departamento de Tolima). El aislado identificado fue recolectado en las coordenadas geográficas (5°5.9´7.6" LN y 75°3´38.2" LO) y altura de 1608 msnm.