Microorganismos asociados a 20 genotipos de cacao especiales, en los departamentos de Santander y Sucre

Study Extent

Sampling

Quality Control

Method steps

1. Se realizaron las colectas de los genotipos CCN51 e ICS95, los cuales se encontraban sembrados en finca de productores de los departamentos de Sucre y Santander. Para proceder la fermentación de los granos de mazorca se utilizó cajones de fermentación tipo semi-escalera para cada genotipo con una capacidad de 242,15 kilos de cacao fresco. Posterior a las 48 horas de fermentación se ejecutó el primer volteo y posteriormente volteos cada 24 horas hasta alcanzar la fermentación completa de los granos ocurrida a los siete días de iniciado el proceso. Para posterior, aislamientos de los microorganismos, se ejecutó diluciones seriadas 10-3, 10-4 y 10-5 por triplicado en medios de cultivo Agar GYC, Agar MRS y Agar YGC e incubados a una temperatura de 30 ± 2 °C durante 48 °C. Una vez Purificado los aislamientos en sus respectivos medios de cultivo.
2. Se realizó una descripción de los aislamientos mediante observaciones micro y macroscópicas de los cultivos puros, usando para las observaciones microscópicas con tinción de Gram. Para la caracterización macroscópica, los cultivos puros se monitorearon a las 48 horas días después de siembra, describiendo características como forma, margen, elevación, superficie, aspecto, color y forma de la célula. La caracterización morfológica permitió la agrupación de levaduras y bacterias en morfotipos, acorde a la semejanza en las características microscópicas y macroscópicas. Se procedió a la obtención de ADN genómico de las cepas bacterianas utilizando el protocolo interno y la extracción de ADN de hongos y levaduras se efectuó empleando un kit comercial de la marca Mo Bio (AllPrep® Fungal DNA/RNA/Protein Kit) siguiendo el protocolo del fabricante.
3. Las cepas fúngicas se identificaron usando las secuencias del gen ITS ARN ribosomal. La amplificación por PCR del ADN se realizó empleando el kit Tucán Taq (CorpoGen®). La amplificación se hizo utilizando los primers ITS5 (GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG) e ITS4 (5'GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-'3). Las muestras de ADN fueron obtenidas para cada colonia individual de cada cepa y la amplificación del gen 16S ARN ribosomal se efectuó mediante el empleo de los siguientes primers: 337F(GACTCCTACGGGAGGCWGCAG), 518F(CCAGCAGCCGCGGTAATACG), 800R (TACCAGGGTATCTAATCC), y 1100R (GGGTTGCGCTCGTTG). Los productos de PCR amplificados se separaron por electroforesis en geles de agarosa al 1 %. Las en buffer TAE1X. Como revelador se empleó EZ-vision® (Amresco Inc., USA) y como marcador molecular Gene ruler de 1kb de (Thermo Fisher Scientific Inc., USA). El gel fue observado en un equipo para análisis y documentación de geles (Biorad Gel Doc XR System, USA). Los productos PCR fueron secuenciados por CorpoGen® utilizando el secuenciador utilizado es un ABI PRISM® 3730XL Analyzer (96 capillary type, USA), siguiendo los protocolos de los fabricantes. Para las levaduras se ejecutó la limpieza y ensamblaje de las secuencias para obtener la secuencia problema. Usando el software Bioedit (Versión 7.0.5.3., Carlsbad, USA).
4. Posteriormente, se realizó el análisis taxonómico de la secuencia mediante la herramienta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), del NCBI (National Center for Biotechnology Information), comparando contra la colección de nucleótidos (nr/nt), del mismo NCBI, que comprende las bases de datos: GenBank, EMBL (European Molecular Biology Laboratory), DDBJ (DNA Data Bank of Japan), PDB (Protein Data Bank) y RefSeq. A su vez, se determinó otros análisis taxonómicos de la secuencia mediante la herramienta BLAST comparando contra la base de datos de UNITE (https://unite.ut.ee), Ultimando, con la clasificación taxonómica. Para las bacterias, las secuencias obtenidas fueron limpiadas y ensambladas en una secuencia consenso, empleando el software Bioedit (Versión 7.0.5.3., Carlsbad, USA), para obtener la secuencia problema.
5. Seguidamente, se realizó el análisis taxonómico de las secuencias problema mediante la herramienta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), del NCBI (National Center for Biotechnology Information). La conservación de los microorganismos se llevó a cabo por la técnica de crioconservación, se dispensó 1 mL de solución estéril (121°C, 15 minutos) cuya composición v/v fue glicerol al 10 % y agua destilada, en viales estériles para levaduras obtenidas por crecimiento en medio YGC ®, los cuales se suspendieron en la solución estéril. Para las bacterias se aplicó glicerol v/v 30 % y agua destilada, en viales estériles obtenida por crecimiento en medio GYC medio MRS®, resuspendidos en solución estéril. A continuación, los viales de los microorganismos obtenidos fueron sometidos a procesos de congelación gradual y almacenados a una temperatura de -80 °C.

1. Bacteria
   rank: kingdom
2. Fungi
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