Biobanco de parasitología de Chagas (Sangre) del Instituto Nacional de Salud

Study Extent

Instituto Nacional de Salud de Colombia

Sampling

Se consideraron potenciales participantes todos los pacientes que acudieron al Instituto Nacional de Salud de Colombia (Total 985 personas) en busca de pruebas diagnósticas para la enfermedad de Chagas en fase aguda (113 pacientes) o crónica (872 pacientes) entre 2004 y 2015. Los criterios de inclusión fueron: i. Sospecha clínica o epidemiológica de enfermedad de Chagas en fase aguda o crónica ii. No haber recibido tratamiento etiológico para la enfermedad de Chagas iii. Pruebas serológicas positivas para la enfermedad de Chagas (IFA, ELISA y/o HAI) iv. Disponibilidad de muestras de sangre y suero adecuadas para la realización de pruebas diagnósticas según la fase clínica. v. Aceptación para participar y firma del consentimiento informado.

Method steps

1. Clasificación clínica. Fase aguda: Se definió como caso sospechoso a un individuo con > 7 días de fiebre acompañada o no de hepatomegalia o esplenomegalia. El paciente fue considerado con enfermedad de Chagas aguda si además de los síntomas daba positivo por pruebas parasitológicas (Strout, micro-strout, gota gruesa de sangre o hemocultivo) o presentaba resultados positivos a dos pruebas serológicas en el transcurso de las siguientes semanas. Los pacientes fueron clasificados como negativos a la enfermedad de Chagas por lo demás señalado.
2. Fase crónica: Individuos sin criterios de fase aguda pero con sospecha clínica o epidemiológica de enfermedad de Chagas. Los pacientes fueron confirmados como positivos T.cruzi, al dar positivo en dos pruebas serológicas (IFA, ELISA y/o HAI). Luego se clasificó como crónica indeterminada (cuando no se evidenciaron signos o síntomas de complicaciones cardíacas) o crónica determinada de otra manera.
3. Pruebas de laboratorio. Métodos parasitológicos. Los métodos parasitológicos directos se realizaron (Strout, micro-strout, gota gruesa de sangre o hemocultivo) de acuerdo con la metodología descrita por Freilij et al., 1983. Los resultados se consideraron positivos cuando la morfología compatible con la T . cruzi fue observado. Todas las muestras fueron analizadas sin conocimiento del estado clínico u otra prueba.
4. Pruebas serológicas: El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), el ensayo de anticuerpos de inmunofluorescencia (IFA) o el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HAI) se estandarizaron originalmente en el Instituto Nacional de Salud con T.cruzi cepas pertenecientes a TcI. Todas las pruebas serológicas se realizaron por duplicado y se utilizaron controles positivos y negativos para cada ensayo. La prueba ELISA se consideró positiva cuando la absorbancia fue ≥0,300, IFA cuando los títulos fueron ≥1/32 y HAI cuando los títulos fueron ≥1/32.). Todas las muestras fueron analizadas sin conocimiento del estado clínico u otras pruebas. Los resultados indeterminados en las pruebas de serología (ELISA e IFI) se resolvieron mediante el uso de la prueba HAI.
5. Pruebas de diagnóstico molecular. Se recolectaron 10 ml de muestras de sangre y se almacenaron con un volumen igual de clorhidrato de guanidina 6M, tampón EDTA 0,2 M, pH 8,00 (GEB) y posteriormente se almacenaron a 8 °C. Se congelaron 5 ml de suero a -70 °C. Se emplearon alícuotas de 300 microlitros de GEB y se añadieron 5 microlitros de plásmido IAC (40 pg/microlitros) como control interno. Las muestras se sometieron a extracción de ADN utilizando el kit High Pure PCR Template Roche según Duffy et al., 2013. PCR convencional (cPCR) y PCR cuantitativa multiplex (qPCR) para la detección de ADN satélite de T.cruzi y el ADN del plásmido IAC. La prueba qPCR se consideró positiva cuando la amplificación superó el umbral de fluorescencia 0,01 y cPCR cuando se observó un fragmento de ADN de 166 pb en la electroforesis. Las muestras positivas para PCR nuclear satelital (qPCR y cPCR), fueron confirmadas por kPCR. Las cargas parasitarias por qPCR se midieron como equivalentes de parásitos por ml según Moreira et al., 2013, utilizando una cepa TcI como curva estándar (MHOM/CO/01/DA]. Todas las muestras se analizaron sin conocimiento del estado clínico u otras pruebas.
6. Discriminación de DTU. La PCR se realizó utilizando cinco marcadores moleculares diferentes destinados a detectar las seis DTU y las dos subdivisiones de TcI descritas previamente por otros autores (TcIDom y TcI sylvatic).

Este conjunto de datos comprende 774 registros biológicos. Se encuentran distribuidos en el reino Protozoa, filo Euglenozoa, clase Kinetoplastea, orden Trypanosomatida, familia Trypanosomatidae. El 100% está clasificado a nivel de especie.

1. Trypanosoma cruzi
   rank: species

Las muestras recolectadas se procesaron y analizaron en el Instituto Nacional de Salud, sede Teusaquillo, Avenida calle 26 No. 51-20