Comunidad de bacterias y hongos que viven como epífitos y endófitos en macroalgas localizadas en Ulva lactuca

Study Extent

La zona se caracteriza por presentar una plataforma rocosa que favorece el establecimiento de una diversa comunidad macroalgal, dentro de la cual la especie U. lactuca es de las más dominantes. Las muestras de la macroalga fueron colectadas en dos eventos de muestreo que se llevaron a cabo el 26 y el 27 de enro del 2023.

Sampling

Se emplearon pinzas estériles para desprender los talos macroalgales del sustrato rocoso y arenoso. Una vez colectadas, las algas fueron sumergidas en agua de mar para remover material particulado y algunos organismos adheridos al talo. Posteriormente fueron almacenadas en frascos de plástico previamente esterilizados, los cuales se colocaron en una nevera de icopor a 4° C que fue transportada al laboratorio de Microbiología Ambiental de la universidad Jorge Tadeo Lozano en Bogotá. En el laboratorio se lavaron nuevamente los especímenes macroalgales con solución salina estéril al 0.85% para limpiar residuos de arena o microrganismos incrustados, los cuales deben ser eliminados antes de iniciar los protocolos de aislamiento de bacterias epíbiontes y endóbiontes. Inmediatamente después se llevaron a cabo los protocolos para el aislamiento y purificación de los microorganismos epífitos y endófitos con técnicas de cultivo tradicional en medio zobell. Los aislamientos obtenidos fueron sembrados en los medios nutritivo mas guaicol, Aleksandrov y ACC para evaluar su capacidad de producir la enzima lacasa, solubilizar potasio y producir la enzima ACC deaminasa.

Quality Control

Se tomaron varias medidas para asegurar la calidad de los resultados: 1) Uso estricto de técnicas de asepsia 2) Repetición de las pruebas de screening hechas a los aislamientos para asegurar la caracteristica positiva en relación a su capacidad de producir lacasas, solubilisar potacio y producir ACC deaminasa.

Method steps

1. Aislamiento de microorganismos epibiontes. Se obtuvieron tres fragmentos de 1 g de peso húmedo de cada una de las tres muestras de macroalgas. A continuación, cada uno de estos fragmentos se colocaron en 50 ml de una solución de NaCl estéril (0,85 %) y se agitaron a 130 rpm durante 25 min. 100 µl de la solución resultante se colocaron por triplicado en tres placas de Petri con agar Zobell para el aislamiento de bacterias y en agar PDA con NaCl (0.85 % p/v) para el aislamiento de hongos.Tras la inoculación, todos los cultivos se incubaron a 29 °C, temperatura similar a la registrada en el lugar de colecta. Los aislamientos microbianos obtenidos se volvieron a inocular en medio fresco a temperatura ambiente hasta obtener aislados puros. Todos los aislamientos se sembraron en medio nutritivo más guiacol, medio Aleksandrov y medio ACC para determinar la presencia de microorganismos productores de lacasas, solubilizadores de potasio y productores de ACC. Aislamiento de microorganismos endobiontes. Una muestra de 5 g de peso húmedo de talo de macroalga se sumergió en etanol al 70 % durante 50 s. A continuación, la muestra se sumergió en una solución estéril de NaCl al 0,85 % para eliminar el etanol residual. Seguido, cada talo se homogeneizó en 20 ml de agua desionizada durante 10 minutos utilizando una licuadora estéril. El homogeneizado resultante se inoculó en agar marino Zobell y en PDA más NaCL (0.85 % p/v) por triplicado, utilizando 100 µl de cada muestra. Este procedimiento se realizó con 3 muestras de macroalgas. Los aislamientos microbianos de endobiontes se cultivaron en los medios anteriores y se incubaron a 29 °C, después se reinocularon en medio fresco hasta obtener aislamientos puros. Aleksandrov y medio ACC para determinar la presencia de microorganismos productores de lacasas, solubilizadores de potasio y productores de ACC.
2. Identificación taxonómica de los microoganismos. Se utilizó la secuencia 16S rARN para determinar la identidad de los microorganismos aislados. La amplificación de esta región por PCR se realizó utilizando los cebadores universales 8F 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'- y 1541R 5'-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3'. El inóculo de una colonia de todas las bacterias aisladas se utilizó como fuente de ADN molde para la reacción. Cada inóculo se suspendió en 10 µl de agua de grado molecular. Las reacciones de amplificación se realizaron en un termociclador (Labnet TC96-CM-10 Multigene Gradient) con un volumen de reacción final de 25 µl. Las mezclas de reacción contenían tampón de reacción PCR 1X, 2 mM de MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 250 nM de cebadores directo e inverso, 1U de Taq polimerasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.) y 1 µl de suspensión bacteriana. Se utilizó el siguiente programa de termociclado: desnaturalización inicial a 94 °C durante 4 min; seguida de 30 ciclos a 94 °C durante 50 s, 55 °C durante 45 s y 72 °C durante 50 s; con un paso final de extensión a 72 °C durante 5 min. Los amplicones fueron secuenciados en el Centro de Secuenciación Genecore de la Universidad de Los Andes utilizando el método Sanger. Los archivos de secuencia resultantes se evaluaron y editaron utilizando el software BioEdit Sequence Alignment Editor. Tras la edición de los archivos de secuencia y los procedimientos de curación, las secuencias resultantes se compararon con las disponibles en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) utilizando el programa Blast.

Este conjunto de datos contiene 125 registros de los reinos Bacteria (121) y Fungi (4), pertenecen a 15 ordenes, 21 familias y 30 géneros. Un 100% está identificado a nivel de género.

1. Proteobacteria
   common name: Bacteria rank: phylum
2. Actinobacteria
   common name: Bacteria rank: phylum
3. Firmicutes
   common name: Bacteria rank: phylum
4. Basidiomycota
   common name: Hongo rank: phylum
5. Bacteria
   rank: kingdom
6. Fungi
   rank: kingdom

Las muestras de Ulva lactuca, a partir de las cuales se aislaron los microorganismos epífitos y endófitos incluidos en este reporte fueron colectadas en la Punta de la Loma, al frente del aeropuerto de la Ciudad d eSanta Marta en las coordenadas: 1) 11°07’00.9” N 74°14’01.3”W. 2) 11°07'03" N 74°14'01"W.