Plagas asociadas a los cultivos de Pimienta, Asaí, Sacha inchi y Mora en el departamento de Putumayo

Study Extent

En el departamento de Putumayo, fueron muestreadas diferentes áreas de producción de los cultivos de Asaí, Mora, Pimienta y Sacha inchi, incluyendo viveros, ubicadas en los municipios de Orito, Puerto Asís, Puerto Caicedo, Valle de Guamuez y Villa Garzón.

Sampling

Se colectaron muestras de tejido vegetal con síntomas de enfermedad y suelo de estas mismas plantas para su posterior procesamiento e identificación del agente causal en los laboratorio de fitopatología del Centro de Investigación (C.I.) Nataima (Espinal-Tolima) AGROSAVIA y Laboratorios de diagnóstico fitosanitario vegetal del Instituto Colombiano Agropecuario (ICA) en Ibagué, Tolima y Villavicencio, Meta. En cada predio comercial, se realizó una exploración a lo largo de éste, con el fin de buscar plantas enfermas, con síntomas asociados posiblemente por un agente causal biótico que presentara uno o varios niveles de lesión (inicial, medio o avanzado). Para el caso de las enfermedades con síntomas más recurrentes, una contramuestra fue embalada y enviada para ser analizada en los laboratorios del Instituto Colombiano Agropecuario (ICA). El método de colecta de material vegetal y suelo fue llevado a cabo de acuerdo con las instrucciones de toma de muestras de esta institución. Previo a la colecta de cada muestra, georreferenciación y código de las muestras fueron anotados, además se realizó un registro fotográfico de las lesiones observadas en el campo de cada una de las muestras colectadas.
Posteriormente, de acuerdo con el tipo de tejido afectado y el grado de infección presentado, fueron tomadas muestras de tejido entre sano y enfermo empleando elementos de colecta. Toda la herramienta utilizada para la toma de las muestras fue previamente desinfectada con amonio cuaternario. De esta manera, de acuerdo con cada lesión, fueron tomadas diferentes secciones de las plantas, así: Toma de muestras de hojas: fueron cortados segmentos del tejido con ayuda de tijeras podadoras, en sentido transversal del peciolo (mora, pimienta, sacha inchi) o ráquis (asaí), evitando afectar la lámina foliar. Toma de muestras de tallo y/o raíz: fueron tomadas muestras de tejido vegetal asociadas a marchitamiento vascular y/o pudriciones. Para esto, tejido afectado con estos síntomas fue cortado de forma transversal en el tallo y raíces, con ayuda de machete y palín previamente desinfectado. Los trozos de cada tejido, tanto de tallo como de raíz enfermo, fueron empacados primero en bolsas de papel Kraft de 30x40 cm aprox., para luego embalarlos en bolsas plásticas de cierre hermético. Material de vivero: Síntomas asociados a enfermedades también fueron detectados en vivero de asai, por lo que, para el análisis de laboratorio fue tomada la plántula completa. Para esto, inicialmente fue retirado el sustrato cuidadosamente, con el fin de no afectar las raíces de la plántula. Posteriormente, estas plántulas fueron embaladas en papel wypall, para luego ser empacadas en bolsas herméticas. Finalizado el embalaje y rotulado de todas las muestras, fue diligenciado el formato "Solicitud de análisis y diagnóstico fitosanitario" formato ICA. Posteriormente, las muestras fueron empacadas en neveras de icopor de 40 L para luego ser llevadas al laboratorio de fitopatología de Nataima-Agrosavia, donde fueron mantenidas a 18ºC antes del aislamiento del patógeno. Para el caso de las muestras de enfermedades más recurrentes, una contramuestra fue embalada y enviada para el Instituto Colombiano Agropecuario (ICA), para la identificación y reporte legal del agente causal o patógeno.

Quality Control

A partir de los cultivos puros de los aislamientos, se colecto aproximadamente 0.5 g de tejido fúngico para posteriormente ser liofilizado y pulverizado. A continuación, se utilizó el kit DNeasy Plant Mini de Qiagen® para realizar la extracción de ADN de cada uno de ellos siguiendo las instrucciones del fabricante. La calidad del ADN extraído fue establecida mediante espectrofotometría con Nanodrop One; aquellas muestras que mostraran relaciones de A260/A280 y A260/A230 cercanas o levemente superiores a ~1.8 y concentraciones superiores a 10 ng/µl pasaron al proceso de detección por PCR. En caso contrario se realizó de nuevo el proceso de extracción. Posteriormente a la obtención del material genético en condiciones aptas, se realizó para cada muestra de ADN de cada aislamiento, la amplificación de tres regiones genómicas para eucariotes por PCR (por sus siglas en inglés Polymerase Chain Reaction): 1) fragmento interno de ARN ribosomal subunidad 18S con los cebadores NS1 (GTAGTCATATGCTTGTCTC) y NS8 (TCCGCAGGTTCACCTACGGA) (White et al., 1990), 2) Espaciador interno transcrito ITS-1 cebadores (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) y ITS-4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC) (White et al., 1990), 3) fragmento interno del ARN ribosomal subunidad 28S, cebadores LR0R (ACCCGCTGAACTTAAGC) y LR7 (TACTACCACCAAGATCT) (Rehner & Samuels, 1994). Para el caso de procariotas o asilamientos bacterianos se amplificó por PCR una región de la subunidad 16S ribosomal, cebadores 27F (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) y 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACTT). La amplificación de cada muestra con los cebadores empleados fue corroborada a través de la realización de electroforesis horizontal en gel de agarosa, que permitió determinar cualitativamente la presencia o ausencia del fragmento con el tamaño esperado. Los fragmentos positivamente amplificados para cada par de cebadores y muestra fueron purificados y secuenciados con la metodología Sanger en el Laboratorio de Genética Molecular de AGROSAVIA, C.I. Tibaitatá. Para el ensamblaje de las secuencias sentido-antisentido y obtención de la secuencia consenso se empleó la herramienta Tracy. Finalmente, para la asignación taxonómica de la muestra se empleó el algoritmo heurístico BLAST con la base de datos del NCBI para buscar y comparar secuencias anotadas similares a las obtenidas a partir de las muestras, se analizaron las métricas de calidad de los alineamientos para realizar la correspondiente asignación.

Method steps

1. A partir de las muestras de material vegetal afectado que llegó al laboratorio de fitopatología del C.I. Nataima, se tomaron secciones que presentaran etapas intermedias en el sitio de avance del síntoma, para realizar un proceso convencional de desinfección.
2. En condiciones de asepsia el tejido seleccionado fue cortado en trozos de 0,25 cm2; estos trozos fueron lavados con alcohol al 70% por 60 segundos, luego con hipoclorito de sodio al 1% por 60 segundos y finalmente lavados tres veces con agua destilada estéril.
3. Después, se secaron a temperatura ambiente sobre toallas de papel estéril; una vez secos, fueron dispuestos en cajas de Petri (5 trozos por caja) con medios de cultivo.
4. Para síntomas asociados a hongos fueron sembrados en medios de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA); para síntomas de Fusarium en medio de cultivo Dicloran Rosa de Bengala Cloramfenicol Agar (DRBCA); para síntomas asociados a bacterias y para el caso de pudrición fétida en el tallo, fue utilizado el medio de cultivo Agar Nutritivo (AN).
5. Una vez transcurridas 48 horas desde el momento de la siembra, se identificó mediante microscopía la colonia de mayor frecuencia y se extrajo a una nueva caja con el fin de purificar el agente causal; los medios de cultivos usados fueron los mismos descritos anteriormente.
6. Una vez purificados los agentes causales fúngicos de cada enfermedad fueron preservados mediante la técnica de conservación en papel filtro.
7. Paralelamente a la conservación de los agentes causales fúngicos y a partir de cultivos puros, se realizaron montajes no permanentes para observación en microscopía de luz con el fin de determinar características morfológicas taxonómicamente específicas de género y/o especie para cada uno de los morfotipos purificados, empleando un microscopio Carl Zeizz primo star con cámara fotográfica que emplea el software ZEN 2011.
8. Para algunos microorganismos que no fue posible su identificación con las técnicas antes descritas, se realizó el montaje de cámaras húmedas. Las cámaras fueron realizadas en contenedores plásticos herméticos previamente acondicionados y desinfectados con alcohol al 70%. Dentro del contenedor se dispuso una toalla de papel estéril la cual fue humedecida con agua destilada estéril.
9. El tejido que presentaba las lesiones de interés fue lavado con abundante agua y secado con papel estéril y fue dispuesto en las cámaras húmedas. Estas cámaras fueron mantenidas en oscuridad a 20°C durante una semana evaluando diariamente el avance de la enfermedad con ayuda de un estereoscopio.
10. En estos casos, y para identificar el agente causal, se compararon las características macroscópicas y microscópicas identificadas con las referencias bibliográficas de los síntomas y patógeno asociado, con el fin de confirmar el microorganismo causante de los síntomas observados.

Se identificaron microorganismos pertenecientes al grupo de hongos. De los 23 registros, 22 se determinaron hasta el nivel del género, de estos se encontraron 9, donde Cladosporium (6 registros), Colletotrichum y Fusarium (4 registros).

1. Phytophthora
   rank: genus
2. Fusarium
   rank: genus
3. Colletotrichum
   rank: genus
4. Pestalotia
   rank: genus
5. Cladosporium
   rank: genus
6. Botrytis
   rank: genus
7. Verticillium
   rank: genus
8. Oidium
   rank: genus
9. Cercospora
   rank: genus

Las muestras fueron tomadas en el departamento de Putumayo, en los municipios de Orito, Puerto Asís, Puerto Caicedo, Valle de Guamuez y Villa Garzón.