DIATOMEAS COMO BIOINDICADORAS DE DOS ECOSISTEMAS LÓTICOS DE LA PROVINCIA DEL AZUAY

Study Extent

Se escogieron dos ecosistemas lóticos de la provincia del Azuay que difieran en su estado trófico: río Tarqui y río Yanuncay, tributarios del río Cuenca

Sampling

Para el muestreo biótico de las diatomeas, calidad del agua, IHF Y QBR se escogieron 5 puntos de muestreo por cada ecosistema, en los cuales se colectaron en un total 6 muestras diferenciadas de diatomeas epilíticas: tres en la época seca (julio, agosto y septiembre) y tres en la época lluviosa (marzo, abril y mayo) para tener datos de estacionalidad.

Quality Control

Los datos sin procesar emparejados de Illumina para cada biblioteca consisten en lecturas directas (R1) e inversas (R2) almacenadas en archivos separados, que también incluyen los puntajes de calidad de las lecturas. Eliminamos cualquier rastro potencial de dímeros adaptadores utilizando Cutadapt v3.5 ( Martin, 2011 ) .

Se puede acceder a los archivos FASTQ después de la eliminación de los dímeros del adaptador siguiendo el siguiente enlace:

Datos sin procesar

(md5: 6ce7dc35dbdb843d5f31f0683a28724f)

Evaluamos la calidad de los archivos FASTQ con el software FastQC ( Andrews, 2010 ) y resumimos el resultado con MultiQC ( Ewels et al., 2016 ) . Se puede acceder a los informes de control de calidad de las lecturas de R1 y R2 haciendo clic en los siguientes enlaces:

Informe de control de calidad R1

Informe de control de calidad R2

Nota: Ninguno de los controles negativos (BPCR1 y BPCR2) produjo lecturas durante la secuenciación (consulte la Tabla 1).

Method steps

1. Para la determinación del estado ecológico del río se trabajó con los mismos 5 puntos de muestreo por cada ecosistema lótico: Tarqui y Yanuncay, se tomaron datos el estado calidad de ribera (QBR) y el estado del hábitat fluvial (IHF) de acuerdo a los protocolos (Acosta et al., 2014; Encalada et al., 2015; Pardo et al., 2010); en cuanto a la calidad del hábitat fluvial el objetivo  es evaluar las características abióticas y bióticas más importantes presentes en el cauce del río que pueden estar influenciado en la presencia de las diatomeas epilíticas, de acuerdo al tipo de sustrato mineral del cauce y; en cuento a la calidad de ribera el objetivo es establecer el hábitat que influencia sobre la calidad del agua de los ríos y por tanto sobre la presencia o ausencia de distintas comunidades de diatomeas epiliticas y su importancia como bioindicadoras de calidad del agua. Además, se tomaron muestras de agua para establecer sus parámetros físico-químicos en todos los puntos de muestreo, se determinaron parámetros in situ con la sonda multiparámetrica portátil: temperatura, oxígeno disuelto, pH, conductividad y se recolectaron 30 muestras de cada río de acuerdo a los protocolos de la Norma Técnica Ecuatoriana para Agua: Calidad del Agua (2013), se las analizó en el Hidrolab del CITT de la Universidad Católica de Cuenca, tomando en cuenta: demanda biológica de oxígeno (DBO5), nitratos y fosfatos, coliformes fecales y sólidos disueltos totales mediante (Standard Methods Committee, 2020)

   También, se recolectaron muestras de las biopelículas de las piedras que están debajo del agua mediante el raspado con cepillo de dientes (Castillejo et al., 2022; Lobo et al., 2016; Pardo et al., 2010) las mismas que se colocaron en botellas oscuras con agua destilada 60%, 30 % etanol y 10% de formol concentrado al 40% (Pardo et al., 2010). En laboratorio fueron oxidadas mediante peróxido de hidrógeno, ácido clorhídrico y dicromato de potasio para liberarlas de la materia orgánica y montarlas como frústulos permanentemente en portaobjetos con la resina Naphrax®  y cubreobjetos redondos (Cambra et al., 2005; Water Quality — European Committee for Standardization, 2003; Pardo et al., 2010). La identificación taxonómica se realizó mediante en un microscopio con DIC (contraste de interface diferencial) Nikon Elipse E200 bajo un aumento de 100X. De esta forma, se registraron aleatoriamente las especies encontradas en cada campo para llegar, siempre que fue posible, a 400 individuos. En el caso de muestras cuya concentración no era la adecuada se realizaron barridos completos de la placa simulando un zig-zag. Para la identificación se utilizaron claves (Lobo et al., 2016; Metzelin & Lange-Bertalot, 2007; Rumrich et al., 2000).

   Para la extracción de ADN metagenómico se tomaron muestras de biopelícula de las piedras a las cuales no se les colocó ningún aditivo, en el laboratorio se partió con un volumen inicial de 250 ml de cada punto de muestreo de los ríos Yanuncay y Tarqui. Las muestras fueron homogenizadas y posteriormente, se colectó 10 ml en tubos cónicos. Para concentrar la muestra se centrifugó a 15000 rpm por 10 minutos, el sobrenadante fue descartado. El pellet que se formó se resuspendió en 600μL del Lysis Buffer, volumen empleado para la extracción del DNA siguiendo las instrucciones del protocolo de extracción PureLink Microbiome (Thermo Scientific, USA), modificando la temperatura de incubación a 80°C por 15 minutos. El DNA obtenido fue diluido en 100 μL Elution Buffer. 

   La calidad del ADN se determinó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% y la cuantificación se realizó empleando un espectómetro de microplacas Epoch TM con la finalidad de verificar la cantidad requerida para el análisis molecular. Los análisis de metabarcodificación de ADN fueron realizados por AllGenetics & Biology SL (www.allgenetics.eu). De acuerdo a  Vasselon et al., (2017), se amplificaron regiones del gen de la rbcl (marcador cloroplástico) empleando los primers: Diat_rbcL_708F_1 (AGGTGAAGTAAAAGGTTCWTACTTAAA) 

   Diat_rbcL_708F_2 (AGGTGAAGTTAAAGGTTCWTAYTTAAA)  y 

   Diat_rbcL_708F_3 (AGGTGAAACTAAAGGTTCWTACTTAAA) 

   Como forward primers, combinado con una mezcla equimolar de dos primers 

   Diat_rbcL_R3_1 (CCTTCTAATTTACCWACWACTG) (Stoof-Leichsenring et al., 2015) and Diat_rbcL_R3_2 (CCTTCTAATTTACCWACAACAG) como reverse primers.

   Estos cebadores también incluían las secuencias del cebador de secuenciación de Illumina unidas a sus extremos 5'.

   Para el control de datos de secuenciación se evaluó la calidad de los archivos FASTQ con el software FastQC ( Andrews, 2010) y se resumieron  resultados con MultiQC (Ewels et al., 2016). Las lecturas de amplicón se procesaron con QIIME 2 (versión 2022) (Bolyen et al., 2019). En cuanto a la asignación taxonómica, se consultó sus secuencias representativas en una instancia local de la base de datos GenBank del NCBI (actualizada por última vez en octubre de 2022) utilizando el algoritmo BLASTn v2.12.0+ (Camacho et al., 2009), y configurando los siguientes parámetros: porcentaje de identidad del 97 %, e-value de 1e-05 y una cobertura mínima de aciertos del 80 %.

Bacyllariophyta son una clase de Algas unicelulares microscópicas. Conocidas también como diatomeas, son uno de los más comunes tipos de fitoplancton. Pertenecen al reino Cromista y al dominio Eucarya

1. Bacillariophyceae
   common name: DIATOMEAS rank: class

PROVINCIA DEL AZUAY