Microorganismos relacionados a la producción del cultivo de ñame espino en la región Caribe de Colombia

Study Extent

Departamento de Córdoba (Municipio: Cereté, San Pelayo, Puerto escondido, Moñito, Los Córdobas. Veredas / Corregimientos: El Terron, El Líbano, Cuero curtió, Las Cuevas, Pueblo Yuca, El Ley, Morindó Santa Cruz). Departamento de Sucre (Municipio: Los palmitos y Ovejas. Veredas/ Corregimiento: Palma de Vino, Puerto Asís, San Jaime, Palma de Vino, La Pista, San Rafael, El Diamante, Buenos Aires y Villa Fanny). Departamento de Bolívar (Municipio: San Juan Nepomuceno, Carmen de Bolívar y San Jacinto. Veredas/ Corregimiento: Cañito, Santa Catalina, San Isidro, Guamito, Tierra Grata, El Limón, El Bled y Peralonso).

Sampling

A través de fuentes secundarias, se identificaron las principales zonas productoras de ñame en los departamentos de Córdoba, Sucre y Bolívar en la región Caribe de Colombia y se realizaron visitas a predios 44 de productores en donde se efectuaron colectas de tubérculos del ñame cv. "Espino", que se encontraban en almacenamiento para ser usados como semilla en la siguiente temporada de siembras. Los tubérculos colectados se seleccionaron por presentar síntomas de la afectación, fueron empacados en bolsas de papel kraft y transportados en neveras a una temperatura entre -4 y -8 °C al Laboratorio de Microbiología Agrícola del Centro de Investigación Turipaná de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria-Agrosavia, ubicado en el municipio de Cereté, departamento de Córdoba.

Quality Control

Región ITS1-ITS4, Calmodulina y β-Tubulina-2.

Method steps

1. Colecta de semillas. Se realizó un recorrido por las zonas productoras de ñame de la Costa Caribe, colectando tubérculos de ñame, reservados por los agricultores para ser usados como semilla en la siguiente cosecha. Se seleccionaron tubérculos con síntomas de afectación por enfermedades, los cuales fueron transportados en neveras de Icopor (-4 a -8 °C) al Laboratorio de Microbiología Agrícola Centro de Investigación Turipaná.
2. Aislamientos. En laboratorio se realizó una desinfección superficial del tubérculo con hipoclorito de sodio al 2% y enjuague con agua destilada. Luego se tomaron rodajas de 10-12 mm de grosor del tejido afectado, se enjuagaron en agua con detergente durante cinco minutos, y se dejaron en hipoclorito de sodio al 5% durante dos minutos. Posteriormente, se lavaron durante 30 minutos en agua corriente. Luego, se cortaron secciones de un centímetro cuadrado las cuales se sumergieron en alcohol al 70% durante un minuto y se enjuagaron con agua destilada estéril. Seguidamente, estas porciones fueron sembradas en medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA)® suplementado con amikacina 1mL/L e incubadas a una temperatura 28 ± 2 °C durante 7 días (Montiel et al., 2016). Para obtener cultivos puros, se realizaron resiembras sucesivas, de los cuales los micelios y conidios fueron ensamblados en diapositivas usando Azul de Lactofenol® y visto de bajo un microscopio binocular (DM500 Leica®, USA).
3. Características macroscópica y microscópica. Las descripciones macroscópicas se realizaron teniendo en cuenta la metodología propuesta por Pacasa-Quisbert (2017); se tuvo en cuenta la coloración, textura, superficie, exudado y tipo de borde, para el anverso de las colonias crecidas en las cajas de Petri con medio PDA® según Stchigel (2000) y el reconocimiento de estructuras microscópicas con base en las descripciones de Barnett y Hunter (1998). Las estructuras fúngicas fueron utilizadas para la identificación presuntiva a nivel de género, para poder ser ubicados en los diferentes morfotipos.
4. Caracterización molecular. Para la identificación molecular de los morfotipos se procedió a sembrar los aislados en caldo de papa y dextrosa, para obtener micelios, los cuales fueron macerado con nitrógeno líquido para la extracción DNA siguiendo las instrucciones del fabricante de DNeasy Plant Mini Kit® (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA). La PCR se realizó amplificando fragmentos de algunos genes como: región ITS1-ITS4, Calmodulina y β-Tubulina-2. La reacción de PCR se realizó usando el Kit PCR Master Mix (Thermo Scientific®, Lucigen, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante y usando los siguientes juegos de primers: ITS-1F (ITS-1F 5′ CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A 3´), ITS-4 (ITS-4R 5′ TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3´) (Gardes y Bruns 1993; White et al., 1990) y el programa de PCR que se utilizó fue el siguiente, desnaturalización Inicial 95°C por 3 minutos, 35 ciclos a 95°C por 30 segundos de desnaturalización, 55°C por 30 segundos de alineación, 72°C por 45 minutos de extensión y una extensión final de 72°C por 7 minutos. Para el gen de la Calmodulina se utilizaron los primers (CL1-F5´ GAR TWC AAG GAG GCC TTC TC 3´) y (CL2A-R5´ TTT TTG CAT CAT GAG TTG GAC O 3’) (O’Donnell et al., 2000). El programa de PCR fue el mismo de los ITS, pero la temperatura de alineación se ajustó a 57°C. Para la β-Tubulina-2 se utilizaron los primer: T1 (T1-F 5´ AAC ATG CGT GAG ATT GTA AGT 3´), T2 (T2-R 5´ TAG TGA CCC TTG GCC CAGT TG 3´) y (O’Donnell Cigelnik, 1997); con el siguiente programa de PCR, desnaturalización Inicial 94°C por 3 minutos, 10 ciclos a 94°C por 30 segundos de desnaturalización, 46°C por 30 segundos de alineación, 72°C por 1 minuto de extensión; 25 ciclos a 94°C por 30 segundos de desnaturalización, 57°C por 30 segundos de alineación, 72°C por 1 minuto de extensión y una extensión final de 72°C por 10 minutos. Utilizado el equipo termociclador MiniAmp Plus (Applied Biosystems™, Singapur, Asia).
5. La verificación de la calidad de la extracción se realizó corriendo una electroforesis en gel de agarosa al 2% en buffer TAE1X en una cámara de electroforesis horizontal Enduro VE20 (Labnet interntional Inc Taiwán, China). Como revelador se usó EZ-vision ® (Amresco Inc., USA) y como marcador molecular Gene ruler de 1kb de (Thermo Fisher Scientific Inc., USA). El gel fue observado en el un equipo para análisis y documentación de geles Gel Doc XR (BioRad, USA). Los productos PCR obtenidos fueron enviados al laboratorio de genética molecular del Centro de Investigación Tibaitata – Agrosavia para el análisis de secuenciación de Sanger en doble sentido, en el equipo de electroforesis capilar ABI 3500 (Applied Biosystems®, USA).
6. Las secuencias obtenidas se alinearon con secuencias de referencia de la base de datos GenBank® del National Center for Biotechnology Information (NCBI), mediante la herramienta Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). Con las secuencias obtenidas se realizó el análisis filogenético en el software MEGA7, las secuencias se alinearon mediante el programa MUSCLE. La construcción del árbol filogenético se infirió al usar el método de máxima verosimilitud las distancias evolutivas se calcularon utilizando el modelo Kimura de 2 parámetros, para la región ITS y el gen Calmodulina y el modelo Tamura-Nei (Tamura y Nei, 1993) para el gen de β-tubulina-2 y la evaluación del árbol se realizó mediante el método Bootstrap con 1000 permutaciones para asignar niveles de confianza a los nodos en el árbol.
7. Conservación de hongos. Para la crioconservación se dispensó 1 mL de solución estéril (121°C, 15 minutos) cuya composición v/v fue glicerol al 10% y agua destilada, en viales estériles. Las esporas de los hongos obtenidas por crecimiento en medio PDA®, se suspendieron en la solución estéril, a continuación, se sometió la solución a un proceso de congelación gradual y se almacenó a una temperatura de -80 ºC. (Gutiérrez et al., 2009).

Hongos asociados al cultivo de Dioscorea rotundata identificados hasta género o especie. Comprende 134 registros distribuidos en 3 filos, 4 clases, 6 ordenes, 7 familias, 11 géneros y 23 especies. Con un 85% clasificado a nivel de especie y 15% a género.

1. Dothideomycetes
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2. Eurotiomycetes
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3. Mucoromycotina
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4. Sordariomycetes
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Bacterias asociadas al cultivo de Dioscorea rotundata identificadas hasta género y especie. Comprende 20 registros distribuidos en 3 clases, 5 órdenes, 7 familias, 7 géneros y 10 especies. Se clasificó un 95% a nivel de especie y un 5% a nivel de género.

1. Alphaproteobacteria
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2. Bacilli
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3. Gammaproteobacteria
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Caribe Colombiano, departamentos de Córdoba, Sucre y Bolívar.