Colección interna de microorganismos del Laboratorio de Bioprocesos de la Universidad Industrial de Santander

Study Extent

Las muestras de granos de cacao fueron recolectadas en la finca Villa Mónica ubicada en el municipio de San Vicente de Chucurí, departamento de Santander, ubicada a 6° 55´48.265 de latitud y 73° 24´47.971 de longitud.

Sampling

Se recolectaron alrededor de 100 gramos de granos de cacao con pulpa en cinco puntos distintos del cajón de fermentación siguiendo un patrón de diagonales cruzadas, desde el inicio del proceso (tiempo cero) y cada 6 horas a partir del primer muestreo hasta completar 24 horas, a las 36 horas y a las 48 horas. Todas las muestras fueron tomadas a 30 cm por debajo de la superficie de la masa fermentable (Sandoval-Lozano & López-Giraldo, 2018). Las muestras se almacenaron a ≤4 °C en bolsas de polietileno con cierre hermético y fueron trasladadas al laboratorio de Bioprocesos con Microorganismos del CICTA - UIS para su análisis.

Quality Control

En el proceso de estructuración y validación de los datos, se realizó el control de la calidad de la información. A continuación, se enumeran los procesos asociados a esta actividad: 1. Revisión de la información documentada asociada a los datos biológicos; 2. Estructuración de los datos en el estándar Darwin Core (DwC) según elementos, definiciones y vocabularios controlados; 3. Validación y limpieza de la información consignada en el DwC, 3.1. Corrección de errores de tipeo, para esta tarea se usó OpenRefine, adicionalmente se identificaron datos erróneos como sinonimias, con el uso de Species Matching, y COL | The Catalogue of Life; 4. Finalmente, la base datos DwC se validó haciendo uso del Validador de datos - GBIF.

Method steps

1. Aislamiento y purificación de levaduras: 25 gramos de cada muestra colectada fueron adicionados a 225 ml de agua peptonada al 0,1 %. Inmediatamente se realizó una mezcla manual durante 3 min y se obtuvo una solución de granos de cacao con pulpa. Se realizaron diluciones seriadas hasta 10-6 y alícuotas de 100 μl de cada dilución fueron sembradas en placa por esparcimiento en la superficie de cajas con agar Sabouraud (Merck) con 100 mg/L de cloranfenicol (Sigma- Aldrich). Las cajas se incubaron a 30°C por 24 – 48 horas (Pereira, Miguel, Ramos, & Schwan, 2012). Los aislamientos fueron purificados a través de subcultivo y almacenados a -20°C con glicerol al 20%.
2. Identificación taxonómica de levaduras: Se realizó la descripción macroscópica de cada una de las colonias según su color, superficie, forma, elevación y tipo de borde de acuerdo con Kurtzman, Fell, & Boekhout (2011). Para la identificación se realizó así: extracción y purificación de ADN mediante el kit de purificación de ADN genómico Wizard® (Promega) según instrucciones del fabricante y las modificaciones sugeridas por (Serrano Blanco, 2017). El material colectado fue resuspendido en 25µL y preservado a -20°C para su posterior uso. La cuantificación y pureza del ADN se determinó por espectrofotometría a 260 nm de 1,5 a 2 µL de cada muestra en el NanoDrop 2000. Expresada en ng/uL. Para la amplificación se realizó la metodológica propuesta por Bornemann y Hartin, 2000 usando los sets de primers ITS1 – ITS4. Los resultados se verificaron en geles de agarosa al 0,8% con corridas de 80 minutos a 80 Voltios. Las muestras amplificadas fueron enviadas a secuenciación a Corpogen (Bogotá, Colombia). Las secuencias obtenidas fueron editadas y ensambladas con el programa BioEdit V 7.2.5. Las secuencias se recibieron en archivos tipo raw, fasta y electroferogramas de calidad y se analizaron mediante la plataforma Quality Check de Thermo Fisher con el fin de establecer su calidad. Posteriormente, utilizando el software BioEdit, con la herramienta Contig Assembly program, se obtuvo la secuencia del amplicón (Contig). Posteriormente se tomó los “contigs” obtenidos para cada una de las secuencias, se contrastaron con la base de datos del NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch#), de las coincidencias identificadas se tomaron las secuencias con las identidades más altas (>90%), aleatoriamente se seleccionaron entre dos o tres para poder realizar el set de datos.

Todos los taxones fueron identificados mínimo a nivel de reino. En total, se listan diez especies de levaduras, correspondientes a tres familias y seis géneros.

1. Candida
   rank: genus
2. Hanseniaspora
   rank: genus
3. Pichia
   rank: genus
4. Saccharomyces
   rank: genus
5. Torulaspora
   rank: genus
6. Wickerhamomyces
   rank: genus

El área de estudio corresponde a la finca Villa Mónica, municipio de San Vicente de Chucurí, departamento de Santander, Colombia.